背景

CD19作為B細胞表面特異性標志物，是用于治療B細胞惡性腫瘤，如急性淋巴細胞性白血?。ˋLL）和淋巴瘤的理想靶點。然而，CD19的細胞外域（ECD）容易聚集和錯誤折疊，為開發和分析CD19靶向治療帶來了挑戰。研究團隊通過工程化改造，成功獲得穩定的CD19-ECD（SuperFolder）變體，這些變體顯示出改善的表達率，并且與野生型蛋白相比，能夠有效地以單體形式純化。

研究方法

研究人員采用了酵母表面展示技術結合定向進化策略，通過隨機突變和高通量篩選，從大量候選變體中篩選出穩定性提高的CD19-ECD變體。通過流式細胞術（FACS）和熱穩定性測試，對變體的穩定性和表達特性進行了評估。

初步實驗設計

設計四種不同的CD19-ECD構建體，包括是否包含信號肽（SP）和外顯子5（E5），并通過抗標簽抗體（anti-HA和anti-c-myc）及抗CD19抗體（FMC63和HIB19）進行檢測。實驗結果顯示，不包含信號肽和外顯子5的構建體表現最佳（圖1A）。

文庫構建和篩選

利用錯配PCR（error-prone PCR）對CD19-wt基因進行隨機突變，生成初始文庫。隨后，通過流式細胞術（FACS）進行多輪篩選。每輪篩選中，細胞首先用抗HA抗體染色以標準化表達水平，然后根據與FMC63或anti-c-myc抗體的結合情況進行選擇。在某些輪次中，額外加入48°C的熱孵育篩選步驟以增加選擇壓力，從而篩選出具有更高熱穩定性的變體。

活性分析

在多輪篩選后，研究團隊對最終篩選出的庫進行分析。通過流式細胞術檢測表面展示的CD19-ECD與抗體的結合情況，結果顯示篩選后的庫與初始的CD19-wt相比，表現出顯著改進的折疊和穩定性。

圖 1. 用于篩選CD19-ECD 穩定變體的實驗策略和酵母表面展示實驗流程。(A) 酵母展示 CD19-ECD 的示意圖，檢測的四種不同 CD19-ECD 結構與抗-HA 和抗-c-myc以及特異性針對 CD19-ECD 結構的單克隆抗體（FMC63 和 HIB19）的結合能力。(B) FACS篩選策略示意圖。(C) 酵母展示的 CD19-野生型和分選后庫比較。

研究結果

通過多輪篩選成功獲得了穩定的、天然折疊的CD19-ECD變體。這些變體表現出更好的折疊性能和更高的熱穩定性（圖2），并在HEK293細胞中顯示出更高的可溶性表達量（圖4）。

圖2 富集的SuperFolder變體表現出更好的結構完整性和熱穩定性。

圖3 SuperFolder突變在CD19-ECD結構中的位置

圖4 可溶性表達SuperFolder變體產生單體蛋白

最佳突變體SF05的優勢

1. 熱穩定性和表達量：SF05變體在48°C測試中表現出顯著的熱穩定性，并且在HEK293細胞中的可溶性表達量顯著高于野生型CD19。

2. 單體蛋白的純化：與野生型CD19不同，SF05變體能夠以單體形式高效純化，避免了蛋白質聚集問題。

3. 單價親和力分析：SF05變體用于分析在原代人T細胞上表達的CD19定向CAR（基于FMC63 scFv）的單價親和力，結果顯示其在檢測和表型分析方面具有極高的實用性。

4. CAR-T細胞檢測：SF05變體成功用于患者樣本中CAR-T細胞的檢測和表型分析，能夠通過多參數流式細胞術進行CAR-T細胞頻率的定量和CAR表達水平的分析。

圖 5. FMC63-CARs的單價親和力分析及患者體內CAR-T細胞的監測。

小結

SuperFolder CD19-ECD變體的開發，為癌癥免疫治療特別是在B細胞惡性腫瘤提供了新的工具。這些變體不僅可用于基礎免疫學研究，還有助于CD19靶向療法的開發和監測。特別是SF05變體，通過其與CD19-CAR的單價親和力研究，以及在淋巴瘤患者血液中CAR-T細胞的監測和表征，證明了在臨床應用中的潛力。

同時，該項研究成功展示了定向進化和酵母表面展示技術的強大功能，不僅解決了CD19-ECD的穩定性和表達問題，還為其他"難以表達"的蛋白質提供了寶貴的經驗和啟示。

參考文獻：

Laurent E, Sieber A, Salzer B, Wachernig A, Seigner J, Lehner M, Geyeregger R, Kratzer B, J?ger U, Kunert R, Pickl WF, Traxlmayr MW. Directed Evolution of Stabilized Monomeric CD19 for Monovalent CAR Interaction Studies and Monitoring of CAR-T Cell Patients. ACS Synth Biol. 2021 May 21;10(5):1184-1198. doi: 10.1021/acssynbio.1c00010. Epub 2021 Apr 12. PMID: 33843201; PMCID: PMC8155657.

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