前言
通過與酵母細胞壁蛋白融合表達，將目的重組蛋白展示在酵母表面蛋白的方法，稱為酵母表面展示。酵母表面展示技術已經成為一種極具價值的蛋白質工程工具，廣泛應用于生物技術和生物醫學領域。本文將介紹酵母表面展示技術在蛋白工程中的應用。

01親和力成熟

蛋白質的親和力對其結合配體而言是一個關鍵參數，高親和力有利于調節結合復合物的生物學功能。目前，針對于蛋白質親和力成熟的方法眾多，其中最為常見的是定向進化和分子展示技術。在過去的十年里，酵母表面展示技術逐漸成為親和力成熟的常用技術。

使用酵母表面展示的親和力成熟的策略主要包括4個步驟(圖1)：

圖1：通過FACS從酵母表面展示的文庫中分離高親和性蛋白質突變體.^[1]

A. 文庫構建：隨機誘變產生10⁷-10⁹個蛋白質突變體的文庫;

B. 酵母表面展示：基因庫轉化酵母細胞和誘導表面表達，蛋白質突變體表現為與Aga2p細胞壁蛋白的融合體；

C. 利用蛋白配體對展示文庫進行差異標記（兩種策略）：平衡結合策略與動力學結合策略，蛋白質突變體由于親和性不同而導致配體結合產生差異；

D. FACS篩選：添加經熒光標記的抗表位標簽抗體可使酵母表面表達水平隨結合而正?；瑥亩赏ㄟ^FACS分離出高親和性的突變體； 

經分選的酵母克隆可擴增培養以用于分析或后續一輪分選，或可分離提取DNA，經突變后用于轉化新批次的酵母細胞以進行進一步的蛋白定向進化，從而篩選出更高親和力的蛋白。

02蛋白穩定性高
蛋白質的穩定性通常是指其抵抗熱變性和化學變性以及蛋白水解降解的能力。高穩定性是用于研究工業和治療應用的蛋白質的期望特征，同時穩定性的提升可轉化為更長的保存期、活性持續時間和體內活性。與結合親和力一樣，酵母表面展示技術可以在蛋白質突變體仍與酵母細胞表面相連的情況下分析熱穩定性，從而可以快速、定量地測定最大變性(TM)值。
目前，酵母平臺主要利用三種策略工程化增加蛋白質的穩定性(圖2)。三種方法均先通過隨機誘變產生約10⁷至10⁹個蛋白質突變體文庫，并將其作為與Aga2p細胞壁蛋白的融合物進行酵母表面展示，隨后分策略進行高穩定性蛋白質的篩選。

圖2：通過FACS從酵母表面展示的文庫中分離高穩定性蛋白質突變體（點突變顯示為紅色）^[1]

策略一：根據表面表達水平篩選穩定的蛋白質突變體(圖2a)。用突變基因庫轉化酵母通常會顯示出適當折疊和截短的蛋白質突變體，其表達水平在一定范圍內，可用作蛋白質穩定性的替代物。用針對c - myc表位標簽(紫色框)的熒光抗體(綠色星)和對酵母表面展示蛋白的天然折疊特異的配體(紅色星)標記細胞，再通過FACS選擇表達最高水平的正確折疊突變體的細胞。

策略二：根據其抵抗不可逆熱變性的能力篩選穩定的蛋白質突變體(圖2b) 。在細胞分選前對酵母表面展示文庫進行高溫熱應激(85℃，10分鐘)。高溫熱變性一般屬于不可逆變性，故此法更適合于具有較高熱穩定性的蛋白質?；谄渑c熒光標記的抗體或配體結合的能力，通過FACS分選出特異于天然蛋白質折疊的，可抵抗熱變性的酵母表面展示的突變體。

策略三：利用升高溫度的優勢和內質網（ER）的質量控制機制來選擇穩定的突變體。在該方法中，在高達37℃(與通常使用的20℃或30℃相比)的溫度下誘導表面展示的蛋白質表達24小時，以在蛋白質合成期間利用ER對蛋白質的翻譯后處理，使蛋白質結構的平衡向錯誤折疊狀態轉移，同時保持酵母細胞的活力。一般來說，只有在升高的誘導溫度下有效折疊和加工的蛋白質才能避開ER質量控制機制并有效地轉運到細胞表面。然后可以如第一種策略(圖2a)所述對文庫進行分類，以選擇穩定性增加的突變體。

03蛋白酶定向進化

定向進化是改造酶特性的一項強有力的技術。然而，酶的定向進化過程中最大的挑戰則是將酶突變體的基因型與其表型(例如，催化活性或底物特異性)正確聯系，因為在大多數情況下，底物轉換產生的是可擴散的產物，無法共價結合到噬菌體或細胞的表面，而酵母表面展示技術可將酶突變體與錨定蛋白如a-凝集素融合表達，而錨定于酵母細胞壁上。隨著酵母表面展示技術的發展，結合FACS技術可以對包含10⁸個酶突變體的文庫進行篩選，獲得更高活性和底物特異性的酶。
其中，用于酶催化鄰近標記的生物素連接酶TurboID就是通過酵母表面展示定向進化篩選獲得的?？茖W家Tess C. Branon等人^[2]以生物素連接酶BioID(BirA-R118S) 為模板，使用易錯PCR技術合成一個包含有10⁷個連接酶突變體的文庫，每個連接酶突變體平均有兩個氨基酸的突變。將該連接酶突變體文庫展示在酵母表面，加入生物素和ATP啟動雜交生物素化，然后用鏈霉親和素對每個酵母細胞表面的生物素化部位進行染色。通過流式分選富集高度自我生物素化的細胞（圖3）。
科學家通過這種酵母表面展示定向進化生物素連接酶，經過多輪篩選最終獲得更高效率的生物素連接酶突變體TurboID和miniTurbo，這兩種酶使得酶催化標記反應可在10分鐘內完成，大大縮短生物素標記實驗周期且提高標記效率。

圖3. 基于酵母表面展示定向進化的選擇方案。^[2]

連接酶與錨定蛋白Aga2p融合表達，Aga2p通過二硫鍵與Aga1p共價結合錨定在酵母表面。連接酶的C-末端帶有myc表達標簽。將生物素和ATP加入到酵母庫中反應10分鐘到24小時。藍色圓點所示為生物素化標記的位點。用鏈霉親和素染色檢測底物的生物素化程度，用anti-myc抗體染色檢測連接酶的表達。FACS分選富集鏈霉親和素和Myc染色高比例的細胞。

小結    
與核糖體和噬菌體展示等其他技術相比，酵母表面展示的最顯著優勢是可以結合流式細胞儀分析使用，能夠在細胞上定量測量蛋白表達水平、穩定性、親和力和特異性，而不需要可溶性蛋白表達和純化等步驟。此外，酵母表面展示是真核表達系統，能夠產生含有多個二硫鍵的復雜哺乳動物蛋白質。這種獨特的優勢組合使酵母表面展示技術成為應用于蛋白改造中的領先技術。

阿帕克生物酵母表面展示技術平臺在蛋白改造中的應用介紹

阿帕克生物專注于納米抗體研發，將酵母展示技術應用于抗體發現及蛋白質工程等領域，并提供抗體發現、抗體親和力成熟、T細胞受體親和力提高等服務，經驗豐富，歡迎咨詢。

蛋白改造案例分享

1.IL-2：

白細胞介素2 (Interleukin 2，IL-2)是細胞因子的一種，在免疫系統中起重要作用。它是一種負責調節白細胞（白細胞，通常是淋巴細胞）的免疫活性的蛋白質。IL-2的生成是機體受微生物感染時免疫應答的一部分，以區別“自己”與“非己”。IL-2通過與淋巴細胞表面的IL-2 受體（IL-2R）結合來發揮作用。

圖4：IL-2與IL-2R信號傳導通路

NK 細胞是唯一正常情況下表達 IL-2R 的淋巴樣細胞，因此始終對 IL-2 保持反應性。然而非活化的 NK 細胞上只表達 IL-2R 的β鏈和γ鏈，對 IL-2 的親和力低，只對高濃度的 IL-2 發生反應。一旦 NK 細胞活化，就表達 IL-2R 的α鏈，成為高親和力的受體；大劑量的 IL-2 能誘導出一種非特異性的殺傷細胞-LAK細胞（淋巴因子激活的殺傷細胞，lymphokine active killer cell)，可殺傷對NK細胞抵抗的腫瘤細胞。為了從文庫中篩選出與IL2-Rβ/γ相互作用，同時與IL2-Ra不識別或低親和的克隆，基于酵母表面展示平臺，我們在篩選策略上進行了針對性的調整。最終經過幾輪篩選后，獲得目標克隆。以下為野生型及篩選后的比對結果：

圖5：產物鑒定-同型對照（左：WT右：篩選對照）

圖6：產物鑒定-孵育Ra（左：WT ；右：篩選克隆鑒定）

圖7：產物鑒定-孵育Rb（左：WT ；右：篩選克隆鑒定）

最終經單克隆鑒定，成功篩選得到與IL-2Ra不結合，并與IL-2Rβ/γ保持相互作用的克隆。

2. IL-18

細胞因子是在晚期癌癥患者中產生持久反應的現代免疫療法，但它們只有適度的療效和有限的耐受性。研究表明白細胞介素-18（IL-18）通路的成分在腫瘤膨脹的淋巴細胞上上調，這說明IL-18治療可以增強抗腫瘤免疫。然而，有研究發現IL-18BP，一種高強度的IL-18誘餌受體，在不同的人類和小鼠腫瘤中經常上調，并限制了IL-18在小鼠中的抗腫瘤活性。

圖8：IL-18BP可高強度結合白細胞介素-18

為了降低IL-18與IL-18BP的結合，需要通過改造，設計一種可抵抗IL-18BP，且保持信號傳導潛力，但不受IL-18BP抑制的影響的蛋白。

圖9：弱結合IL-18BP篩選示意流程圖

我們通過定向突變得到一個合成文庫，將合成的突變文庫誘導展示在酵母細胞上，進行幾輪篩選得到目標克隆，最終分選得到幾乎不與IL-18BP結合的克隆，誘導其進行表達并對產物進行鑒定，結果如下：

圖10：產物鑒定結果Blank/同型對照/IL-18Ra與IL-18Rb染色/IL-18BP染色。

BP的陽性率（左四）與Ra的陽性率（左三）出現明顯差別，存在一群明顯不識別BP蛋白的細胞群，同時對Ra維持較高的結合。

參考資料：

[1]. Gerald M., et al.  Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Cell Surface Dispaly, Methods,Protocols, and Applications; Bin Liu, Ed.; Springer, 2015, pp.155-170. doi.10.1007/978-1-4939-2748-7_8

[2]. Branon, Tess C et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.Nature biotechnology vol. 36,9 (2018): 880-887. doi:10.1038/nbt.4201

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