前言  

噬菌體展示技術與酵母展示技術是目前抗體研發過程中常用的技術，特別是噬菌體展示技術，其對實驗設備要求很低，常規分子生物學實驗室即可開展該實驗技術，加上大容量的文庫庫容，使得該技術被大家廣泛使用。與之相比，酵母展示技術雖然發展了很多年，但是其對設備要求較高，需要配置流式分選儀，流式分析儀等，加上庫容量有限，所以目前并未被廣泛使用。本文將介紹這兩種技術的優劣勢，以供針對不同靶分子與分子需求時更好地去選擇研發平臺。

酵母展示技術是一種廣泛應用于研究和工業生產的通用工具，最早由Maarten P. Schreuder及其同事在1993年報道了酵母細胞壁外源蛋白的展示，K. Dane Wittrup和同事在1997年報道了酵母表面多肽展示文庫的構建和篩選。目前酵母表面展示技術被廣泛應用于蛋白工程，抗體開發，親和力改造等。

酵母展示的原理

釀酒酵母細胞壁厚且堅硬，約200nm，位于質膜外，主要由甘露蛋白和β-鏈葡聚糖組成，具有雙層結構，包括內部的葡聚糖骨架層，以及主要由甘露蛋白組成的纖維狀或刷子狀外層(圖1)。

圖1 釀酒酵母細胞表面結構

通常，目的蛋白的展示通常是通過與宿主酵母細胞壁蛋白融合表達而實現的，常用的錨定蛋白如a-凝集素、Flo1p、Yps1p、Cwp2p、Sed1p、Pir1-4等（圖2）。展示的蛋白經分泌途徑，首先被轉運到內質網腔內，然后從內質網轉運到高爾基體，最終錨定于細胞壁表面。常用的錨定蛋白如a-凝集素由Aga1基因編碼的核心亞基和Aga2基因編碼的核心亞基組成，Aga1與Aga2亞基通過二硫鍵相連，并通過AGA1蛋白C端的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定于細胞壁。展示的目的蛋白可選擇融合于Aga2亞基的N端或C端進行構建，納米抗體片段VHH融合于N端或C端均可進行高效表達和篩選。

圖2 不同的釀酒酵母細胞表面展示系統

酵母表面展示主要是通過MACS/FACS來進行篩選，篩選過程采用FACS進行監測，非常直觀與方便。

噬菌體展示的發展歷史及應用概述

噬菌體展示（phage display）是一種利用實驗室進化，高通量、高內涵地淘選具有特定結合能力的多肽或抗體的分子生物學技術，已廣泛用于生物醫藥、新材料、新能源及環保相關的基礎與應用研究中。這項技術最初由George Smith在20世紀80年代中期開發，并在90年代初由John McCafferty和Gregory Winter應用在抗體工程領域。2018年，噬菌體展示研究的兩位先驅，美國科學家喬治·史密斯（George P. Smith）和英國科學家格雷格·文特（Gregory P.Winter）榮獲諾貝爾化學獎。

噬菌體展示的原理

噬菌體展示技術是將外源的多肽，抗體等片段，插入到噬菌體的結構基因，常見的是與PIII或PVIII融合表達，被展示在噬菌體表面的分子仍然保持生物活性。要從噬菌體文庫中挑選中我們想要的分子，就要經過 “淘篩”。該過程簡單地說就是被展示在噬菌體表面的肽庫或者蛋白庫能夠特異地與目標抗原識別并結合，經過足夠時間的孵育之后，可使用洗滌液洗去與抗原結合較弱或者未結合的游離噬菌體。隨后將特異性結合的目標噬菌體洗脫下來，感染大腸桿菌并進行擴增以得到下一輪的子噬菌體庫。隨后經過2輪～3輪的“吸附-洗脫-擴增”富集過程后，能夠與抗原特異性結合的噬菌體的比例得到了逐步提高。最終獲得能夠識別靶分子的多肽或者蛋白，可被用于后續的實驗。

Phage display VS Yeast surface display  

雖然兩種展示系統都能夠實現基因型與表型的統一，且被廣泛應用于抗體開發，但是在蛋白表達系統，庫容量，篩選方式等方面，二者存在很大差異。

蛋白表達系統

噬菌體是一種病毒，需要感染大腸桿菌才能進行復制與擴增，是原核表達體系。但抗體是來源于真核，由于密碼子的偏好性，不能夠讓有些抗體能夠得到有效的展示或有毒，導致克隆丟失。而酵母是真核表達系統，展示的抗體首先轉運至內質網腔內，然后經高爾基體進行加工，能夠保證蛋白的正確折疊，具有更接近真核表達蛋白的修飾特征及更良好的生物學的活性。

庫容量

由于大腸桿菌的轉化效率要遠高于酵母細胞，一般噬菌體文庫可達到10⁹。而在很長的一段時間由于技術的限制，酵母文庫的庫容量只能達到10⁶~10⁷，因此酵母表面展示一般用于親和力成熟，這種突變文庫，其對庫容量要求不高。納米抗體不涉及傳統抗體輕重鏈體外重組，阿帕克生物經過技術改良目前文庫庫容量能夠保證10⁸，完全能夠滿足納米抗體的研發需要。

構建文庫方式

噬菌體展示文庫采用酶切連接或者同源重組，其中酶切連接的方式大家最常用，相對于體外同源重組成本更低。體外同源重組可以大大提高連接效率，但成本非常高。酵母表面展示是將線性化的目的片段和線性化載體按一定比例電轉化酵母感受態細胞，片段和載體會在酵母細胞內通過同源重組的方式環化為質粒，成本低廉，操作簡單。

展示效率與拷貝數

在抗體開發過程中，噬菌體展示文庫一般采用單價展示，為了達到單價展示，包裝后展示效率大約10%左右，但是并沒有有效的檢測手段去監測文庫的包裝效率，非常讓人頭疼。如果篩選不好，可能是展示效率不好導致的，引入了更多的變量，建議采用抗g3p 抗體，檢測包裝效率。

酵母表面展示會帶檢測標簽比如HA，Flag，myc等，可以非常方便的通過流式確定文庫表達效率，一般展示效率可以達到60%~80%。酵母表面展示是多價展示，一個酵母上大約會有10⁴~10⁵個拷貝。

展示形式

噬菌體展示承載分子量有限一般將多肽，VHH，ScFv或者Fab 融合到PIII蛋白上， Fab片段對噬菌體就相對較大了。 分子量太大，會影響噬菌體的侵染與包裝。然而酵母展示除了可以展示上述的片段外，還可以展示整個抗體IgG分子全長，這是噬菌體展示無法做到。

偏向性

噬菌體的偏向性非常嚴重，主要是由3個方面引起的：a.噬菌體是原核體系，而抗體來源于真核，由于密碼子的偏好性和有些分子對E.coli有毒，導致克隆生長過程中生長速率不一致，甚至導致克隆丟失；b.沒有插入片段的克隆，生長速度遠遠超過插入片段的克隆，導致文庫質量降低；c.ORF讀碼框不正確，也會導致這類克隆生長過快。酵母一般不會存在這類問題，生長相對較均一。

篩選方式

酵母展示最直接的優點是在FACS篩選過程中對選擇參數的精確控制。收集的種群百分比，信號歸一化，和所需的結合親和力可以通過流式細胞術劃定邊界。這種在選擇過程中定義結合標準的能力比噬菌體展示平臺具有優勢，在噬菌體展示平臺上，變異識別依賴于洗滌步驟，而不是實時動力學觀察。換句話說，在酵母文庫選擇過程中，這種對理想結合特性的系統性偏向在噬菌體文庫篩選中是不存在的。酵母表面展示的篩選方法與流式細胞術提供的定量和多參數分析兼容。可對緩沖液組成、pH、溫度和抗原濃度等條件進行精確控制，分選在特定孵育條件下與靶蛋白結合的克隆，如可分選在特定條件下穩定性提升的克隆，同時可以逐個分析文庫中的每個細胞，以實時了解展示水平及其抗原結合情況，并分選出特定的細胞群。我們以實際案例來展示酵母篩選的優勢：

a.基于親和力的分選

噬菌體篩選高親和力克隆是通過增加選擇壓比如包被抗原濃度，洗滌強度等方法，但是卻不能進行有效監控，同時篩選到的克隆只能區分陽性，不能分辨親和力高低，只能在蛋白表達后再做親和力比較，導致工作量大，成本高。酵母展示是通過將待分選文庫經不同濃度的靶蛋白孵育后，在一定的靶蛋白孵育濃度下可區分不同親和力的抗體展示克隆，并按需求進行分選。如圖6所示，分選細胞與不同濃度靶蛋白孵育后的流式圖譜，可觀察到在11.1nM濃度條件下對不同親和力的細胞群有較明顯的區分,可以按親和力高、中、低劃分不同分選區進行分選，直接分選高親和力群。這種方式也可以反應出文庫中是否有高親和力的群，以及不同親和力群的占比。

圖6 基于不同親和力的流式分選

（靶蛋白孵育濃度從左至右分別為100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.2nM）

b.Blocking 活性抗體分選

對于免疫檢查點的靶點，為了獲得具有生物學功能的抗體，需要阻斷受體與配體的結合。常規的噬菌體篩選是先拿到結合的抗體，表達驗證后再驗證是否能blocking 受體與配合的結合，效率低，成功率不高。酵母表面展示是通過對配體蛋白或bench mark抗體進行染色標記，通過競爭分選來獲得。如分選PD-L1的阻斷抗體，將PD-L1和PD-1標記為不同的熒光，與文庫細胞共孵育后分選表達信號陽克隆中PD-L1熒光信號陽而PD-1信號陰的克隆，見圖7所示分選圖譜，分選F-Q1區細胞，經鑒定細胞結合PD-L1后不再結合PD-1，即抗體具有阻斷PD-L1與PD-1結合的功能，效率非常高。

(1)

（2）

圖7 特定表位分選及鑒定圖譜（1：PD-L1標記熒光650，PD-1標記熒光PE，分選650信號陽性且PE信號陰性的區域F-Q1；2：分選產物流式鑒定圖譜，左信號PD-L1-647/HA-488，右信號PD-1-PE/PD-L1-647）

out put 克隆陽性率與數據分析深度

噬菌體的篩選類似于ELISA，一般會通過2~3輪的panning，這個過程為了保證克隆的多樣性，應盡量減少淘洗的輪次，不要讓output陽性率太高。其次絲狀噬菌體比較黏，容易出現非特異，酵母則是通過檢測表達標簽與抗原結合雙陽信號來控制，非特異非常低。酵母展示一般第一輪進行MACS富集，第二輪采用FACS進行分選，直接分選特定群，通過控制分選精度，可以讓陽性率達到90%以上，且不丟失多樣性。傳統的克隆分析是通過挑取單克隆來進行驗證與sanger測序，一般挑取5~10塊板，這種方式往往挑選到的都是豐度比較高的克隆，對于低豐度的克隆，很難通過這種方式獲得，數據量有限。酵母展示除了這種挑單克隆的方式來獲得克隆外，阿帕克生物采用分選特定群10w+的陽性克隆，進行NGS測序，分析深度是傳統挑克隆無法比擬的，獲得的數據可以進行豐度排序，或者基于CDR3進行cluster聚類，輕松獲得上百條后選克隆。噬菌體由于比較黏且容易非特異，NGS測序的結果陽性克隆的置信度非常低，往往我們合成的克隆沒有幾個是陽性。

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