前言

釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 是生物技術領域中常用的微生物之一，因其在大規模生產、具有真核后翻譯修飾能力以及遺傳學良好表征等方面的優勢，被廣泛用作異源蛋白表達的宿主。然而，許多異源蛋白在酵母中表達時面臨著進入或有效通過分泌途徑的挑戰，導致產量低下。同時，在蛋白質工程中，酵母表面展示技術也因實現高水平重組蛋白表達而備受關注。為了解決這些問題，科學家們開發了酵母模塊化克隆(MoClo)工具包，該工具包利用IIS型限制性內切酶從標準化部分高效組裝表達載體。本文將介紹該工具包的擴展及其在優化釀酒酵母中異源蛋白分泌和表面展示中的應用。

酵母中的蛋白質分泌和表面展示

在釀酒酵母中，蛋白質分泌通常由信號肽(SP)啟動。SP通過后翻譯或共翻譯轉運機制(如Sec和SRP依賴途徑)將分泌蛋白引導進入內質網 (ER)。信號肽包括帶正電荷的N區、疏水性α螺旋H區和含有切割位點的C區，這些區域對于蛋白質的高效分泌至關重要。

除了蛋白質分泌，酵母表面展示技術也在蛋白質工程中有著廣泛應用。表面展示技術通過將目標蛋白質錨定在酵母的細胞表面，使其能夠與外界環境相互作用。這對于抗體篩選、疫苗開發和酶工程等具有重要意義。然而，實現高效的表面展示也面臨諸多挑戰。

圖1. 構建及組裝策略示意圖。

(A) 將不同類型的氨基端分泌促進序列與目的蛋白和羧基端3xFLAG-6xHis標簽結合,評估其分泌效率,或與HA表位標記的錨定蛋白結合用于表面展示實驗。
(B) 使用酵母模塊化克隆工具箱中的標準部件,評估一系列分泌促進序列(SP)和轉錄因子蛋白(TFP)的酵母表達構建體,除了3a'和3b'部件是通過自定義的突出序列(紅色文字)連接的。
(C) 類似的表達構建體被用來評估酵母表面展示錨蛋白,它們被組裝為標準的4a部件類型,編碼有一個柔性連接子(GGGGSGGGGS)、一個HA表位標簽和一個TEV蛋白酶切位點,位于錨定蛋白的上游。
POI=目的蛋白

MoClo 工具包的擴展

MoClo 工具包的工作原理是利用 IIS 型限制性內切酶，通過標準化部分高效組裝表達載體。為了進一步優化異源蛋白分泌和表面展示，該研究擴展了 MoClo 工具包，增加了16種信號肽 (SPs) 和翻譯融合伙伴 (TFPs)，以及5種表面展示錨定蛋白。這些擴展部分經過充分表征，可以更高效地引導異源蛋白通過酵母的分泌途徑，并實現高效的表面展示。

研究方法

在實驗中，研究人員使用五種不同的目標蛋白，以驗證分泌促進信號的有效性。通過比較細胞內和分泌蛋白水平，評估每個信號肽和翻譯融合伙伴對蛋白質分泌效率的影響。此外，還研究了信號肽與表面展示錨定蛋白的組合，觀察其對表面展示效率的影響。

研究結果

研究結果顯示，不同的信號肽和翻譯融合伙伴對異源蛋白的分泌效率有顯著影響。對于每種目標蛋白，最佳的分泌促進序列各不相同。例如，某些信號肽對某些蛋白質的分泌有顯著促進作用，而對其他蛋白質則效果不佳。

圖2. 評估一系列分泌促進序列對納米抗體和mRuby2熒光蛋白表達的影響。

使用所示的分泌信號肽(SP)和轉錄因子蛋白(TFP)將重組蛋白靶向分泌。通過Western印跡檢測細胞培養基和細胞沉淀物中的分泌和胞內蛋白,并檢測羧基端6xHis標簽。
(A) 利用所有SP和TFP,anti-GFP納米抗體都能很好地分泌(上圖),且可以從表達GFP的HEK293T細胞裂解物中捕獲GFP,證實其功能性(下圖)。
(B) 只有一半的SP和一個TFP能有效地促進mRuby2熒光蛋白的分泌,這通過Western印跡(上圖)和對培養基進行熒光測量(下圖)得到驗證。
(C) 野生型和工程化的MFα前體-前體信號肽變體在促進mRuby2分泌方面存在顯著差異,這通過Western印跡(左圖)得到證實。定量了三次獨立實驗的蛋白水平(中圖),并計算了培養基與細胞沉淀物樣品中蛋白水平的比值,作為相對分泌效率的指標(右圖)。分子量標記的大小以kDa為單位標示。誤差線代表標準誤差。

圖3. 利用SP/TFP系統進行甜味蛋白的重組生產。通過Western印跡評估重組甜味蛋白的表達和分泌情況,如前所示。

(A) 大部分但并非全部的SP和TFP能夠促進brazein的適度分泌。
(B) 在促進單鏈monellin最佳分泌的SP和TFP之間存在顯著差異。分子量標記的大小以kDa為單位標示。

此外，研究還發現，信號肽與表面展示錨定蛋白的組合對表面展示效率也有重要影響。一些特定的組合能夠顯著提高重組蛋白在酵母表面的展示水平。這些發現表明，選擇合適的信號肽和錨定蛋白組合，對于實現高效的蛋白質分泌和表面展示至關重要。

圖4. 評估五種錨定蛋白用于anti-GFP納米抗體的表面展示。將anti-GFP納米抗體與所示錨定蛋白及AGA2前分泌信號肽(A)或MFαpp8前體-前體信號肽(B)一起在酵母細胞中表達。使用Alexa-488熒光素標記的抗HA抗體或GFP蛋白結合的方式,通過流式細胞術評估其表面展示。未轉化的BY4741細胞作為陰性對照。圖中顯示了FL1信號(Alexa-488或GFP熒光;Y軸)與前向散射(FSC;X軸)的關系,以及陽性染色細胞的百分比。

結論

通過擴展酵母模塊化克隆 (MoClo) 工具包，研究人員提供了一組經過充分表征的信號肽、翻譯融合伙伴及表面展示錨定蛋白。這些工具能夠幫助科學家高效篩選和優化釀酒酵母中的異源蛋白分泌和表面展示。該研究突顯了使用 MoClo 工具包在蛋白質工程中的優勢，通過組合信號肽、翻譯融合伙伴和錨定蛋白，顯著提高了蛋白質分泌效率和表面展示水平，為基礎研究和工業應用提供了新可能性。

未來，隨著更多信號肽和錨定蛋白的發現和表征，MoClo 工具包有望進一步擴展和優化，為生物技術領域帶來更多突破。這項研究展示了科學家在優化酵母表達系統方面的努力和成果，預示著未來在生物制藥、疫苗開發和酶工程等多個領域的發展潛力。

參考文獻：

O'Riordan NM, Juri? V, O'Neill SK, Roche AP, Young PW. A Yeast Modular Cloning (MoClo) Toolkit Expansion for Optimization of Heterologous Protein Secretion and Surface Display in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synth Biol. 2024 Apr 19;13(4):1246-1258. doi: 10.1021/acssynbio.3c00743. Epub 2024 Mar 14. PMID: 38483353; PMCID: PMC11036508.

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