前言  
目前國內外有多家企業采用酵母表面展示技術用于抗體藥物發現，其中將該技術應用最為深入廣泛的是Adimab公司。Adimab的核心技術是利用酵母平臺進行抗體發現和抗體成熟工程。Adimab是全球唯一擁有商業化人源全長抗體庫酵母展示技術平臺的公司，獨特的酵母技術使得Adimab成為了抗體藥開發領域的獨角獸企業，憑借這一特點，Adimab與各大知名藥企達成了合作，已經幫助各大藥企完成超過55種臨床藥物的開發。信達生物包括信迪利單抗在內的多個抗體藥產品都是來源于Adimab的酵母展示技術平臺。

本文將介紹目前已經上市的應用酵母展示技術開發的抗體藥物以及阿帕克生物使用酵母展示技術篩選納米抗體的經典案例。

圖1 Adimab合作企業

應用酵母展示技術開發的上市和臨床中的抗體藥物

1.信迪利單抗（Sintilimab）

2018年12月24日，信達生物制藥開發的創新藥物PD-1抑制劑達伯舒?（信迪利單抗注射液），被批準用于治療經典型霍奇金淋巴瘤。

信迪利單抗是由酵母展示技術平臺開發出的PD-1抗體，能特異性結合T細胞表面的PD-1，阻斷導致腫瘤免疫耐受的 PD-1/ PD-L1通路，重新激活淋巴細胞的抗腫瘤活性，從而達到治療腫瘤的目的。

2.托萊西單抗 （Tafolecimab）

PCSK9是由肝臟產生的絲氨酸蛋白酶，與肝細胞表面的LDL受體(LDL-R)結合，使LDL-R降解，血漿LDL-C水平升高。

目前有 9 款國產PCSK9單抗藥物在研，由信達生物利用酵母展示庫全人源抗體研發平臺研發的托萊西單抗是一種IgG2單克隆抗體，能特異性結合血漿中的游離PCSK9分子，通過減少PCSK9介導的低密度脂蛋白受體（LDLR）內吞來增加LDLR水平，繼而增加LDL-C清除，降低LDL-C水平。

托萊西單抗注射液獲得了“重大新藥創制”國家科技重大專項支持，是國內首個PCSK9遞交新藥上市申請獲受理的，有望成為國內首款獲批的自主研發的重組全人源抗PCSK-9單克隆抗體，擬開發用于治療非家族性高膽固醇血癥（non-FH）及雜合子家族性高膽固醇血癥（HeFH）等適應癥。

3.CD47單抗（Letaplimab)

CD47是一種跨膜蛋白，它通過與巨噬細胞表面的信號調節蛋白(SIRP)相結合，阻止巨噬細胞的吞噬作用。

Letaplimab，也是來源于酵母展示庫全人源抗體技術，目前已在臨床Ⅱ期階段。Letaplimab能夠阻斷CD47與SIRP的結合，進而增強巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，并促進了T細胞的交叉激活。

臨床前數據顯示Letaplimab 作用靶點明確、作用機制清楚、藥效顯著。連續給藥4周，最高無嚴重毒性反應劑量為100 mg/kg，每周一次，具有較好的安全性。1a期臨床數據顯示Letaplimab完成了所有預設劑量的爬坡，最高探索劑量為30mg/kg QW，各劑量組均未發生劑量限制性毒性，整體耐受性良好。

阿帕克生物應用酵母展示技術在抗體藥物開發中的應用介紹 

1.應用酵母展示技術篩選中和抗體

PD-1是一種免疫檢查點抑制劑，主要由細胞表達的PD-L1激活。在癌癥中，PD-L1的表達是主要的免疫逃逸機制之一。此類免疫檢查點抑制劑的目標是通過阻斷負通路來“釋放剎車”并增強T細胞活化，增強免疫系統對腫瘤的抵抗。

阿帕克生物使用Human PD-L1蛋白免疫羊駝后，制備納米抗體酵母表面展示文庫。通過磁珠篩選原始文庫，富集識別PD-L1的酵母細胞。再利用流式分選技術，分選具有PD1/PD-L1阻斷活性的酵母細胞群。再將分選到的克隆進行測序和單克隆流式鑒定，確認所得克隆為滿足要求的陽性克隆。PD-1中和抗體篩選策略詳細步驟可以參見《應用酵母展示技術篩選阻斷活性抗體》一文。

2.識別同源蛋白獨特抗原表位的抗體篩選

當靶點的同家族蛋白彼此同源性較高時，采用何種制備技術與篩選方法至關重要。以CD16a(FcγRIII)為例，帶您了解阿帕克生物如何應用酵母表面展示技術篩選特異性識別CD16a的納米抗體。

CD16a(F176)/CD16a(V176)/CD16b同源性高達96%，噬菌體展示技術平臺很難篩選到特異識別CD16a，而不識別CD16b的納米抗體。但是應用酵母表面展示技術，可以在每輪篩選結束后進行FACS鑒定，并且直接分選特定群落的陽性抗體，獲得高特異性陽性克隆，以實現特異性識別CD16a抗體的篩選。
阿帕克生物使用CD16a(F176)、CD16a(V176)蛋白混合物免疫羊駝，制備納米抗體酵母展示文庫。對原始文庫進行磁珠篩選與流式分選，最終分選出特異性識別CD16a的納米抗體。項目方案設計和詳細篩選策略可以參見《酵母表面展示篩選特定表位納米抗體》一文。

3.相同表位抗體篩選

阿帕克生物利用酵母展示技術，采用對照抗體競爭篩選的方法，可以實現識別特定表位納米抗體的篩選。

篩選策略首先采用X抗原進行磁珠富集，將原始免疫文庫中識別X抗原的納米抗體富集出來（圖2），通過流式分選儀和對照抗體進行競爭分選（圖3），將富集到的克隆進行測序及單克隆流式鑒定，結果顯示獲得的大部分單克隆能夠與對照抗體競爭結合靶抗原(圖4)。

圖2 磁珠富集產物流式鑒定圖譜

左圖：未染色的細胞；

中圖：單染表達標簽HA；

右圖：酵母展示抗體抗原X共孵育染色，流式分選得到G門中的細胞。

圖3 酵母展示抗體進行抗原表位競爭分選

橫軸為表達標簽HA的熒光信號，縱軸為結合抗原X的熒光信號。

左一：未染色的細胞；

左二：單染表達標簽HA；

左三：酵母展示抗體與抗原X共染色；

左四：酵母展示抗體與對照抗體，抗原X共孵育染色。

圖4 單克流式鑒定酵母展示抗體與抗原X結合

橫軸為表達標簽HA的熒光信號，縱軸為結合抗原X的熒光信號。

酵母展示抗體與抗原X，共孵育染色。

圖5 單克隆流式鑒定酵母展示抗體與對照抗體競爭結合

橫軸為表達標簽HA的熒光信號，縱軸為結合抗原X的熒光信號。

酵母展示抗體與抗原X，對照抗體，共孵育染色。

圖4與圖5對比可知獲得的大部分單克隆能夠與對照抗體競爭結合靶抗原。

結語

在酵母表面展示技術平臺中，由于可以采用流式分析技術對篩選過程精確控制，更能體現出應用在抗體藥物發現過程中的優勢。

參考資料：

1. Feldhaus, M., Siegel, R., Opresko, L. et al. Flow-cytometric isolation of human antibodies from a nonimmune Saccharomyces cerevisiae surface display library. Nat Biotechnol 21, 163–170 (2003). https://doi.org/10.1038/nbt785

2. McMahon C, Baier AS, et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6. Epub 2018 Feb 12. PMID: 29434346; PMCID: PMC5839991.

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