自主超突變酵母表面展示（autonomous hypermutation yeast surface display，簡稱AHEAD^[1]）是一種利用酵母進行抗體生產的方法，它模仿動物體細胞超突變過程。通過在一種易錯的正交DNA復制系統上編碼抗體片段或突變蛋白片段，表面展示的抗體庫通過酵母培養和富集的簡單周期持續突變，以進行抗原結合。這樣，在短短兩周內就可以產生高親和力克隆。這種方法為抗體發現或突變蛋白篩選提供了非凡的速度、簡單性和有效性。

AHEAD的本質是利用了一套正交DNA復制系統，這是一種可以在不干擾宿主復制機制的情況下復制目的DNA的系統（圖一）。在該系統中存在兩種細胞質質粒：P1和P2，它們分別獨立編碼質粒自我復制的DNA聚合酶TP-DNAP1和TP-DNAP2。對P1編碼的TP-DNAP1進行改造后得到易出錯的突變體TP-DNAP1^Y427A，將該突變體反式構建于一個穩定遺傳的細胞核質粒中（圖二），該細胞核質粒表達出的DNA聚合酶TP-DNAP1^Y427A可以高突變的復制P1質粒，但不提高宿主基因組的突變率^[2]。這會導致p1編碼的基因以每堿基10^-5次替換的突變率持續發生超突變，比酵母基因組每堿基10^-10次替換的基因組突變率高100,000倍。如果將抗體或突變蛋白的DNA片段構建在p1上，酵母細胞會自我多樣化展示抗體蛋白，并自主探索序列空間。該系統的突變率可以通過對DNA聚合酶TP-DNAP1的改造而顯著增加，但不影響基因組復制，從而支持體內連續進化。該過程允許通過連續幾輪抗原結合分選來快速改進抗體克隆(圖三)，從而在短時間內產生高親和力、高質量的抗體克隆。

圖一 正交復制系統模式圖

圖一 正交復制系統模式圖（正交系統的DNA聚合酶不會對宿主基因組的復制產生影響，正交系統的DNA合成和宿主基因組合成相互獨立）

圖二 正交復制系統質粒p1/p2

圖二 正交復制系統質粒p1/p2（將易突變的TP-DNAP1反式構建于核粒中，表達的TP-DNAP1^Y427A可以復制p1質粒，其中宿主基因組和核粒由宿主核酸聚合酶系統復制，不發生高突變，而p1質粒由TP-DNAP1^Y427A復制，復制過程中發生高突變）

AHEAD系統的搭建和操作流程（圖三）

1. AHEAD系統的設計和構建：首先搭建易出錯的正交DNA復制系統，通過向酵母細胞中引入編碼易出錯的DNA聚合酶的質粒來實現，再將需要突變的目的片段插入高突變p1質粒的特定位置。

2. 復制和突變：培養構建的酵母細胞，易出錯的DNA聚合酶在復制過程中會向目的DNA引入隨機突變，從而導致突變的DNA序列種群多樣化。

3. 選擇和富集：培養和富集酵母細胞以獲得所需的表型，例如抗原結合。使用熒光激活細胞分選(FACS)對酵母細胞進行分類，分離出對抗原具有最高親和力的細胞。該過程允許選擇在DNA中具有突變的酵母細胞，從而改善抗原結合。

4. 質粒提取和測序：從酵母細胞中提取含有抗體片段的質粒，然后進行下一代測序(NGS)，以鑒定抗體庫中發生的突變。

5. 迭代周期：該過程重復了幾個周期，每個周期都會在抗體庫中產生一組新的突變，這樣可以持續改進抗體克隆。

6. 抗體生產：生產和純化高親和力抗體克隆，用于各種應用。

總而言之，AHEAD過程涉及通過簡單的酵母培養和富集抗原結合周期，持續突變展示在酵母細胞表面的抗體庫。該過程允許在短短兩周內快速生成高親和力抗體克隆。

圖三 自主超突變酵母表面展示（AHEAD）（p1質粒中Ab表示抗體片段；DNAP表示DNA聚合酶；HA表示血凝素標簽；Aga2為酵母錨定蛋白亞基；Trp1為色氨酸合成基因，實現p1質粒的穩定傳代）

AHEAD系統應用于抗體親和力提升的案例

該系統被用來生成針對SARS-CoV-2 S糖蛋白和G蛋白偶聯受體的強效納米抗體（圖四）。實驗方法包括在p1上編碼抗體片段，并對其進行連續的分選以進行抗原結合。實驗結果表明，持續多樣化的抗體迅速得到改善，可以在短時間內產生高親和力、高質量的抗體克隆。就SARS-CoV-2 S糖蛋白而言，AHEAD生成的納米抗體對病毒表現出強大的中和活性。與人免疫球蛋白G1（IgG1）抗體同型融合的抗RbD納米抗體對SARS-CoV-2偽型病毒顯示出卓越的中和效力，比其親本序列改善了約925倍。同時，AHEAD實驗的并行性凸顯了保持每個親本克隆譜系分離的價值，因為早期優秀的家系可能無法超過最初表現不佳的譜系，而最初表現不佳的譜系卻可能最終產生最強大的中和抗體，比如在所有進化的變異中，納米抗體RBD1i13和RBD11i12具有最強的病毒中和能力，但它們卻來自于中和能力相對較差的親本。

圖四 抗SARS-CoV-2納米抗體的進化和活性（a、展示了一個抗SARS-CoV-2納米抗體（母本=RBD10）的親和力成熟過程，紅色多邊形為分選的門。b、展示了從不同母克隆開始進行的八個獨立AHEAD實驗中固定的納米抗體突變位置。c、展示了使用AHEAD進化的選擇性抗SARS-CoV-2納米抗體的SPR曲線和相關單價親和力。每個納米抗體都被測試為固定的Fc融合物，流過其中列出的RBD濃度，RU表示響應單位。d、展示了假SARS-CoV-2病毒上選擇性抗SARS-CoV-2納米抗體的中和活性，每個納米抗體濃度（x軸）都進行了復測。n=6，誤差條代表±s.d.。e、展示了在存在使用AHEAD進化的選擇性抗SARS-CoV-2納米抗體時，測量ACE2競爭RBD結合的生物層干涉儀跟蹤。f、在每個母體納米體的親和力成熟過程中，從AHEAD的不同循環中分離出的納米體的親和力和中和效能的提高。每個填充圓圈代表一個納米抗體的親和力，相同顏色的空心圓圈代表納米抗體的中和效能。每個圓圈內部的數字指定了從中分離出該納米抗體的AHEAD周期）

AHEAD系統應用于天然文庫篩選的案例

AHEAD系統可以編碼各種天然抗體庫，充當針對任意靶點生成抗體的現成庫，成功地從編碼在AHEAD上的天然納米抗體庫中篩選到了針對GFP的高親和力納米抗體。

總結

1. AHEAD的系統用于快速抗體進化，該系統通過酵母生長和基于FACS的選擇使YSD納米抗體多樣化。2. 與自然的體細胞超突變不同，AHEAD缺乏突變熱點，但未來的版本可能會模仿突變熱點，并包括新的抗體支架和選擇方法。3. AHEAD被用來快速進化出針對SARS-CoV-2的強效納米抗體，從從天然庫中分離出來的弱親和性納米抗體克隆，在短短1.5-3周的時間內不間斷地進化。4. AHEAD的抗體快速進化核心功能應該能夠實現更廣泛的抗體開發工作。總體而言，AHEAD系統為簡化整個抗體生成提供了一個參考模板。

參考文獻：

[1] Wellner, A., McMahon, C., Gilman, M.S.A. et al. Rapid generation of potent antibodies by autonomous hypermutation in yeast. Nat Chem Biol 17, 1057–1064 (2021).

[2] Ravikumar, A., Arrieta, A. & Liu, C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol 10, 175–177 (2014).

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