納米抗體(Nanobody or VHH)由３個高變區域的抗原互補決定區 (complementarity determiningregions,CDRs)和４個框架區域 (frameworkregions,FRs)組成, 其序列和空間結構與傳統抗體在以下方面的特征。

增加親水性氨基酸與較長的CDR1和CDR3

傳統抗體VH和VL通過疏水作用力來穩定結構并共同構成抗原結合區。與之相比，VHH僅含有3個可變區，盡管與抗原結合界面的表面積減少，但其仍具有較高的穩定性與親和力。它主要通過以下方式來適應輕鏈的缺失：

a. 大量的親水性氨基酸(圖b中黃色圓點）取代先前與CH1、VL結合界面的脂肪族殘基（L12S、V42F/Y、G49E、L50R/C、W52G/L），且部分FR2被拉伸扭轉的CDR3環覆蓋，避免與外界水環境的接觸，從而防止Nbs的二聚化，其CDR3環越長，Nbs越穩定。另外還可在CDR3末端形成疏水核心，有利于穩定Nbs的折疊結構域。

b. VHH的CDR1和CDR3普遍比VH的長，潛在地增加了互補位構象的多樣性，從而以高度的形狀表面互補性與相應的抗原結合，一定程度上彌補了輕鏈缺失造成的抗原結合力下降以及因尺寸小而導致的潛在序列多樣性降低。增長的CDR１區域起源于種系基因，突變熱點的存在導致VHH向N 端延長。而較長的 CDR３區域可能是由于 V-D-J重組后功能性 VHH 域的選擇。

圖1. 重鏈抗體(a)與其可變結構域(b)示意圖  

二硫鍵與 Nb穩定性的關系

通過對比常規抗體與VHH的結構可知，大部分VHH 序列是通過二硫鍵來約束長序列環從而解決由于CDR３區擴展可能引起的穩定性問題。VHH中的二硫鍵類型分為保守和額外二硫鍵。幾乎所有的 VHH 序列有一個連接FR1（C23）和FR3（C104）的保守二硫鍵，該鍵跨越蛋白質的內部，將兩個β鏈連接起來，增加了結構穩定性。部分VHHs還含有一個可限制CDR環柔韌性和構象自由度的額外二硫鍵，且其位置與數量各不相同。研究表明，許多駱駝的VHH 序列在 CDR１區和 CDR３區中均包含一對額外的半胱氨酸(Cysteine,Cys)殘基，它們會形成環間二硫鍵。單峰駱駝的VHH 序列中的環間二硫鍵主要在 CDR１區和 CDR３區之間形成，而部分單峰駱駝的 VHH 序列則在CDR３區和CDR２區之間形成環間二硫鍵。

互補位構象與抗原結合活性

研究表明，VHH CDRs的結構多樣性高于傳統VH域。研究表明VHH的CDR1、CDR2、CDR3區所形成的的環高度可變，這些環在折疊蛋白結構域的一側形成擴展的結構界面，有利于形成抗原結合界面，非常適合插入對應抗原分子的溝槽或裂隙內，增大與抗原的相互作用面積，從而產生了多種抗原結合特異性。 常規抗體的抗原結合片段呈凹陷或平面狀，只能識別抗原表面，而VHH包含１個主要由CDR３環組成的呈扁長形狀且暴露凸起的互補位，可以優先識別裂口，并結合這些隱藏和凹陷的抗原表位，而常規抗體是難以識別這些表位。

近年來關于 VHH的相關研究為從微觀層面認識 Nb的優良結構基礎提供了理論依據。通過對VHH進行結構表征，可指導 VHH定向改造，有望在生物醫藥領域及基因工程方面進行更深層次的應用。

參考文獻：

1. Ciccarese S,et al. The Camel Adaptive Immune Receptors Repertoire as a Singular  Example of Structural and  Functional Genomics. Frontiers in Genetics. 2019.00997

2. Robert J Hoey, H, et al. Structure and development of single domain antibodies as modules for therapeutics and diagnostics. Experimental Biology and Medicine 2019; 244: 1568–1576

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