1995年，Andrew等在護士鯊體內發現了不同于IgM和IgW的新型免疫球蛋白IgNAR，其最初被發現與T細胞抗原受體（T Cell Receptor，TCR）同源性較高，從而被命名為新抗原受體NAR，但是后續研究發現該分子與免疫球蛋白存在諸多類似的結構及功能特性，因此被重新命名為IgNAR，IgNAR與傳統抗體不同，它是由兩條重鏈組成的同源二聚體，缺乏輕鏈（圖1）。與經典的B細胞受體一樣，IgNAR以分泌型和膜結合型的形式存在，由被稱為VNAR的可變區和不同數量的恒定區組成。其中，分泌型具有5個恒定區。

圖1. 鯊魚抗體IgNAR結構示意圖

IgNAR的起源及進化

軟骨魚綱(Chondrichthyes)是與哺乳動物在進化上距離最遠的具有真正適應性免疫系統的脊椎動物，由全頭亞綱(Holocephali)和板鰓亞綱(Elasmobranchii)組成。其中板鰓亞綱可分為鯊總目(Selachimorpha)和鰩總目(Batoidea)。據不完全統計目前鯊總目存在超過450個不同的種，鰩總目存在約560個不同的種，由此可知板鰓亞綱魚類種類遠多于駱駝科動物，為VNAR的開發提供了豐富的材料，由于當前針對VNAR的研究集中于鯊總目，為敘述方便，本文所述VNAR特指鯊源單域抗體。

IgNAR的多樣性來源

與在其他脊椎動物中發現的轉座子(VnDnJnC)基因系統不同，板鰓亞綱魚類的免疫球蛋白(IgM、IgW和IgNAR)基因以基因簇(VDJC)n形式存在(圖2)。每個基因簇由1個V基因片段(Variable gene segment)、多個D基因片段(Diversity gene segment)、1個J基因片段(Joining gene segment)和恒定區外顯子組成。IgNAR也由基因簇中的基因編碼，其每個基因簇中含有3個D基因片段，因此通常需要4次基因重排，才能產生1個完整的VNAR基因序列。由于IgNAR不含輕鏈，缺少重鏈和輕鏈的組合多樣性，同時IgNAR基因簇數量較少，因此IgNAR最主要的多樣性來源于長且高度突變的CDR3區。同時，CDR1、HV2和HV4區的突變也能增加IgNAR的多樣性。此外對VNAR的結構分析表明，非典型半胱氨酸殘基的數量及位置的不同會導致VNAR抗原結合區的構象存在巨大的差異。因此，VNAR中的二硫鍵不僅可以增加結構的穩定性，還能產生各種各樣的構象，從而進一步擴展IgNAR的多樣性。

圖2. 高等脊椎動物和板鰓亞綱魚類免疫球蛋白基因的轉座子及基因簇排列方式比較

VNAR的類型

根據CDR區和FR區中非典型半胱氨酸殘基及保守色氨酸殘基的位置和數量可以將VNAR劃分為不同的亞型。到目前為止，已經定義了3種主要的VNAR，分別稱為類型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。此外有些VNAR只包含2個高度保守的典型半胱氨酸殘基，Liu等和Streltsov等將這些VNAR稱為Ⅱb型。同時將在CDR1區含有保守色氨酸殘基以及只含有典型半胱氨酸殘基的VNAR稱為Ⅲb型。所有當前命名的VNAR類型見圖3。此外，2019年Feng等通過對約119萬條來源于護士鯊的VNAR序列分析發現，護士鯊中存在約5%其他類型的VNAR，其不含或只含有1個半胱氨酸殘基。

圖3. 不同類型的VNAR示意圖（左側為VNAR序列的特征圖，其中黑點為典型半胱氨酸殘基，白點為非典型氨基酸殘基，黑色實線和虛線為二硫鍵。右側為不同類型VNAR的三維結構模型。）

迄今為止，Ⅰ型VNAR只在護士鯊中被發現，可能為該物種所特有。該亞型VNAR分別在FR2和FR4區中存在2個非典型半胱氨酸殘基，同時在CDR3區中也存在2個以上的半胱氨酸殘基。晶體結構分析發現，FR2和FR4中存在的半胱氨酸殘基會與CDR3中的2個半胱氨酸殘基分別形成二硫鍵，從而形成1個緊密結構。需要注意的是，Ⅰ型VNAR由于二硫鍵的束縛導致CDR3區形成的指凸結構的長度較短，難以識別蛋白裂隙深處的抗原表位。

Ⅱ型VNAR與Ⅰ型的不同之處是CDR1區和CDR3區中的2個非典型半胱氨酸會形成二硫鍵，使上述區域靠近，同時CDR3區可形成1個較長的指凸結構，從而易于與蛋白裂隙等隱藏抗原表位結合。迄今為止，在所有研究的鯊魚中都發現了Ⅱ型VNAR。

Ⅲ型VNAR與Ⅱ型類似，在CDR1和CDR3區分別存在1個非典型半胱氨酸，此外該亞型在CDR1區半胱氨酸殘基附近存在1個保守的色氨酸殘基。需要注意的是Ⅲ型VNAR的多樣性較低。據推測，Ⅲ型VNAR是保護新生鯊魚抵御常見病原體的早期廣譜抗體，通常只在幼鯊(< 1歲）中表達。除Ⅲ型VNAR外，所有類型的VNAR都能產生高親和力。

VNAR的主要特性

1. 識別隱藏表位

傳統抗體與單域抗體優先識別不同的抗原表位。這主要是因為傳統抗體的VH-VL界面通常是平面或者凹面，無法識別蛋白裂隙等隱藏抗原表位，而單域抗體的CDR3區通常較長，可以形成指凸結構，從而能夠深入到酶活性中心等蛋白裂隙。

2. 高水溶性和穩定性

IgNAR具有極強的穩定性可在含有350 mmol/L尿素和1 000 mOsm/kg滲透壓鹽離子的鯊魚血液中保持生物活性。IgNAR的穩定性可以歸因于以下2個因素：1)高水溶性，與傳統抗體VH-VL界面相比，VNAR帶有大量的帶電和親水氨基酸殘基，如Tyr37、Glu46、Lys82、Gln84、Arg101和Lys104，其中Glu46、Lys82和Lys104氨基酸殘基的保守性最強，其通過相互之間以及與水分子之間的氫鍵形成1個帶電的內陷結構。此外Tyr37作為免疫球蛋白超家族的保守氨基酸殘基與Gln84、Arg101參與形成CDR3區與FR區的氫鍵網絡，最終使得VNAR形成親水性界面，提高溶解性并保護保守的免疫球蛋白疏水性骨架；2) VNAR的特殊結構，Buchner等發現與哺乳動物抗體相比，VNAR包含1個額外的鹽橋和延伸的疏水核。將這些增強穩定性的結構轉移到人抗體的可變區之后，可顯著提高其穩定性。此外VNAR內部的二硫鍵也有利于提高其穩定性。

VNAR的應用

VNAR所具備的分子量小、親和力高、穩定性強、溶解度好、組織穿透性強以及可識別隱藏抗原表位等特性，使得其在應用時具有產品質量穩定、生產成本低、易儲存以及貨架期長等優點，在藥物開發、體外診斷以及免疫檢測等領域受到廣泛的關注。目前全球有三家公司從事鯊魚抗體藥物研發：Ossianix，Elasmogen，AdAlta，只有AdAlta的AD-214進入臨床研究階段。

總部位于澳大利亞墨爾本的AdAlta是一家創新的臨床階段生物技術公司，基于i-body技術開發靶向纖維化，炎癥和癌癥有關的G蛋白耦聯受體家族 (GPCRs)抗體藥物。AdAlta開創的i-body專利合成文庫技術是將鯊魚抗體CDR1與CDR3嫁接到人類神經細胞粘附因子上，同時在分子內部引入一對二硫鍵穩定蛋白結構，該噬菌體合成文庫超過200億種i-body。 AD-214是AdAlta開發的一種與CXR4特異結合的i-body，同時與人Fc融合，用于治療特發性肺纖維化， AD-214已通過靜脈給藥成功完成 I 期安全性研究。同時AdAlta在開發AD-214可吸入制劑，以提高生物利用率、改善患者便利性并降低成本。

參考資料：

1. 劉星, 陳奇. 鯊源單域抗體的研究進展. 生物工程學報, 2020, 36(6): 1069-1082

2. Juma, S.N.; Gong, X.; Hu, S.; Lv, Z.; Shao, J.; Liu, L.; Chen, G. Shark New Antigen Receptor (IgNAR): Structure, Characteristics and Potential Biomedical Applications. Cells 2021, 10, 1140. https://doi.org/10.3390/ cells10051140

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