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1995年，Andrew等在護(hù)士鯊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不同于IgM和IgW的新型免疫球蛋白IgNAR，其最初被發(fā)現(xiàn)與T細(xì)胞抗原受體（T Cell Receptor，TCR）同源性較高，從而被命名為新抗原受體NAR，但是后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該分子與免疫球蛋白存在諸多類似的結(jié)構(gòu)及功能特性，因此被重新命名為IgNAR，IgNAR與傳統(tǒng)抗體不同，它是由兩條重鏈組成的同源二聚體，缺乏輕鏈（圖1）。與經(jīng)典的B細(xì)胞受體一樣，IgNAR以分泌型和膜結(jié)合型的形式存在，由被稱為VNAR的可變區(qū)和不同數(shù)量的恒定區(qū)組成。其中，分泌型具有5個恒定區(qū)。
圖1. 鯊魚抗體IgNAR結(jié)構(gòu)示意圖
IgNAR的起源及進(jìn)化
軟骨魚綱(Chondrichthyes)是與哺乳動物在進(jìn)化上距離最遠(yuǎn)的具有真正適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的脊椎動物，由全頭亞綱(Holocephali)和板鰓亞綱(Elasmobranchii)組成。其中板鰓亞綱可分為鯊總目(Selachimorpha)和鰩總目(Batoidea)。據(jù)不完全統(tǒng)計目前鯊總目存在超過450個不同的種，鰩總目存在約560個不同的種，由此可知板鰓亞綱魚類種類遠(yuǎn)多于駱駝科動物，為VNAR的開發(fā)提供了豐富的材料，由于當(dāng)前針對VNAR的研究集中于鯊總目，為敘述方便，本文所述VNAR特指鯊源單域抗體。
IgNAR的多樣性來源
與在其他脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子(VnDnJnC)基因系統(tǒng)不同，板鰓亞綱魚類的免疫球蛋白(IgM、IgW和IgNAR)基因以基因簇(VDJC)n形式存在(圖2)。每個基因簇由1個V基因片段(Variable gene segment)、多個D基因片段(Diversity gene segment)、1個J基因片段(Joining gene segment)和恒定區(qū)外顯子組成。IgNAR也由基因簇中的基因編碼，其每個基因簇中含有3個D基因片段，因此通常需要4次基因重排，才能產(chǎn)生1個完整的VNAR基因序列。由于IgNAR不含輕鏈，缺少重鏈和輕鏈的組合多樣性，同時IgNAR基因簇數(shù)量較少，因此IgNAR最主要的多樣性來源于長且高度突變的CDR3區(qū)。同時，CDR1、HV2和HV4區(qū)的突變也能增加IgNAR的多樣性。此外對VNAR的結(jié)構(gòu)分析表明，非典型半胱氨酸殘基的數(shù)量及位置的不同會導(dǎo)致VNAR抗原結(jié)合區(qū)的構(gòu)象存在巨大的差異。因此，VNAR中的二硫鍵不僅可以增加結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還能產(chǎn)生各種各樣的構(gòu)象，從而進(jìn)一步擴(kuò)展IgNAR的多樣性。
圖2. 高等脊椎動物和板鰓亞綱魚類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)座子及基因簇排列方式比較
VNAR的類型
根據(jù)CDR區(qū)和FR區(qū)中非典型半胱氨酸殘基及保守色氨酸殘基的位置和數(shù)量可以將VNAR劃分為不同的亞型。到目前為止，已經(jīng)定義了3種主要的VNAR，分別稱為類型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。此外有些VNAR只包含2個高度保守的典型半胱氨酸殘基，Liu等和Streltsov等將這些VNAR稱為Ⅱb型。同時將在CDR1區(qū)含有保守色氨酸殘基以及只含有典型半胱氨酸殘基的VNAR稱為Ⅲb型。所有當(dāng)前命名的VNAR類型見圖3。此外，2019年Feng等通過對約119萬條來源于護(hù)士鯊的VNAR序列分析發(fā)現(xiàn)，護(hù)士鯊中存在約5%其他類型的VNAR，其不含或只含有1個半胱氨酸殘基。
圖3. 不同類型的VNAR示意圖（左側(cè)為VNAR序列的特征圖，其中黑點為典型半胱氨酸殘基，白點為非典型氨基酸殘基，黑色實線和虛線為二硫鍵。右側(cè)為不同類型VNAR的三維結(jié)構(gòu)模型。）
迄今為止，Ⅰ型VNAR只在護(hù)士鯊中被發(fā)現(xiàn)，可能為該物種所特有。該亞型VNAR分別在FR2和FR4區(qū)中存在2個非典型半胱氨酸殘基，同時在CDR3區(qū)中也存在2個以上的半胱氨酸殘基。晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)R2和FR4中存在的半胱氨酸殘基會與CDR3中的2個半胱氨酸殘基分別形成二硫鍵，從而形成1個緊密結(jié)構(gòu)。需要注意的是，Ⅰ型VNAR由于二硫鍵的束縛導(dǎo)致CDR3區(qū)形成的指凸結(jié)構(gòu)的長度較短，難以識別蛋白裂隙深處的抗原表位。
Ⅱ型VNAR與Ⅰ型的不同之處是CDR1區(qū)和CDR3區(qū)中的2個非典型半胱氨酸會形成二硫鍵，使上述區(qū)域靠近，同時CDR3區(qū)可形成1個較長的指凸結(jié)構(gòu)，從而易于與蛋白裂隙等隱藏抗原表位結(jié)合。迄今為止，在所有研究的鯊魚中都發(fā)現(xiàn)了Ⅱ型VNAR。
Ⅲ型VNAR與Ⅱ型類似，在CDR1和CDR3區(qū)分別存在1個非典型半胱氨酸，此外該亞型在CDR1區(qū)半胱氨酸殘基附近存在1個保守的色氨酸殘基。需要注意的是Ⅲ型VNAR的多樣性較低。據(jù)推測，Ⅲ型VNAR是保護(hù)新生鯊魚抵御常見病原體的早期廣譜抗體，通常只在幼鯊(< 1歲）中表達(dá)。除Ⅲ型VNAR外，所有類型的VNAR都能產(chǎn)生高親和力。
VNAR的主要特性
1. 識別隱藏表位
傳統(tǒng)抗體與單域抗體優(yōu)先識別不同的抗原表位。這主要是因為傳統(tǒng)抗體的VH-VL界面通常是平面或者凹面，無法識別蛋白裂隙等隱藏抗原表位，而單域抗體的CDR3區(qū)通常較長，可以形成指凸結(jié)構(gòu)，從而能夠深入到酶活性中心等蛋白裂隙。
2. 高水溶性和穩(wěn)定性
IgNAR具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性可在含有350 mmol/L尿素和1 000 mOsm/kg滲透壓鹽離子的鯊魚血液中保持生物活性。IgNAR的穩(wěn)定性可以歸因于以下2個因素：1)高水溶性，與傳統(tǒng)抗體VH-VL界面相比，VNAR帶有大量的帶電和親水氨基酸殘基，如Tyr37、Glu46、Lys82、Gln84、Arg101和Lys104，其中Glu46、Lys82和Lys104氨基酸殘基的保守性最強(qiáng)，其通過相互之間以及與水分子之間的氫鍵形成1個帶電的內(nèi)陷結(jié)構(gòu)。此外Tyr37作為免疫球蛋白超家族的保守氨基酸殘基與Gln84、Arg101參與形成CDR3區(qū)與FR區(qū)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，最終使得VNAR形成親水性界面，提高溶解性并保護(hù)保守的免疫球蛋白疏水性骨架；2) VNAR的特殊結(jié)構(gòu)，Buchner等發(fā)現(xiàn)與哺乳動物抗體相比，VNAR包含1個額外的鹽橋和延伸的疏水核。將這些增強(qiáng)穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到人抗體的可變區(qū)之后，可顯著提高其穩(wěn)定性。此外VNAR內(nèi)部的二硫鍵也有利于提高其穩(wěn)定性。
VNAR的應(yīng)用
VNAR所具備的分子量小、親和力高、穩(wěn)定性強(qiáng)、溶解度好、組織穿透性強(qiáng)以及可識別隱藏抗原表位等特性，使得其在應(yīng)用時具有產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、易儲存以及貨架期長等優(yōu)點，在藥物開發(fā)、體外診斷以及免疫檢測等領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。目前全球有三家公司從事鯊魚抗體藥物研發(fā)：Ossianix，Elasmogen，AdAlta，只有AdAlta的AD-214進(jìn)入臨床研究階段。
總部位于澳大利亞墨爾本的AdAlta是一家創(chuàng)新的臨床階段生物技術(shù)公司，基于i-body技術(shù)開發(fā)靶向纖維化，炎癥和癌癥有關(guān)的G蛋白耦聯(lián)受體家族 (GPCRs)抗體藥物。AdAlta開創(chuàng)的i-body專利合成文庫技術(shù)是將鯊魚抗體CDR1與CDR3嫁接到人類神經(jīng)細(xì)胞粘附因子上，同時在分子內(nèi)部引入一對二硫鍵穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，該噬菌體合成文庫超過200億種i-body。 AD-214是AdAlta開發(fā)的一種與CXR4特異結(jié)合的i-body，同時與人Fc融合，用于治療特發(fā)性肺纖維化， AD-214已通過靜脈給藥成功完成 I 期安全性研究。同時AdAlta在開發(fā)AD-214可吸入制劑，以提高生物利用率、改善患者便利性并降低成本。
參考資料：
1. 劉星, 陳奇. 鯊源單域抗體的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2020, 36(6): 1069-1082
2. Juma, S.N.; Gong, X.; Hu, S.; Lv, Z.; Shao, J.; Liu, L.; Chen, G. Shark New Antigen Receptor (IgNAR): Structure, Characteristics and Potential Biomedical Applications. Cells 2021, 10, 1140. https://doi.org/10.3390/ cells10051140
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