前言  
G蛋白偶聯受體（GPCR）作為人體內最大的膜蛋白超家族，調控著細胞對激素，神經遞質的大部分應答，以及視覺，嗅覺，味覺等。GPCR在人體內約有850個家族成員，其中一半被認為是潛在的藥物靶點。目前FDA 批準的藥物中至少有三分之一是針對 GPCＲ，其中小分子藥物占92%，多肽類藥物占5%，蛋白類藥物占2%，抗體藥有2款(Mogamulizumab 和 Erenumab)。據報道，目前上市的藥物中，前50種最暢銷的藥物20%就屬于G蛋白受體相關藥物，比如充血性心力衰竭藥物Coreg，高血壓藥物Cozaar，乳腺癌藥物Zoladex等等。盡管靶向GPCR的藥物開發歷史悠久，但其結構的靈活性和不穩定性，使得以GPCR作為靶點藥物的開發仍具有挑戰性。

GPCR結構解析的難點

GPCR的三維結構可以為以GPCR為靶點的藥物開發提供指導，然而，相比與數目龐大的GPCR家族蛋白，迄今得到結構解析的GPCR任占極少數。

GPCR結構解析的難點在于^[1]，第一如何獲得大量的蛋白。晶體結構解析需要毫克級別的蛋白，GPCR是7次跨膜蛋白，且部分GPCR在天然組織內表達量低，難以通過傳統蛋白純化的方法獲得，而膜蛋白重組表達技術尚存諸多難點，因此研究者們需要開發異源重組表達和純化的方法。第二如何穩定受體的構象。GPCR針對激素和神經遞質的信號感知與傳遞功能歸因于它們靈活多變的可塑性結構。GPCR可以以多種功能上不同的構象狀態存在。盡管這種結構可塑性和動態行為對于GPCR功能是必需的，但是也成為獲得高分辨率穩定狀態晶體結構的障礙，而要獲得穩定的活性狀態下的晶體結構難度更大，這是因為沒有G蛋白結合的GPCR活性構象是極不穩定性。

圖1. Gs(the stimulatory G protein)和Nb80對β2AR的激動劑親和力的影響。

接著，研究者將Nb80-β2AR與小分子完全激動劑BI-167107結合，在脂立方相( Lipidic cubic phase，LCP) 中獲得有活性的3. 5?分辨率的 β2AＲ-T4L-NB80 復合物晶體結構（圖3）。從晶體結構中可以看到Nb80與β2AR的胞質端結合，并且Nb80的CDR3 loop伸向β2AR的核心部位?；钚詷嬒蟮摩?AR-T4L-Nb80與失活狀態的β2AR質端向外移動11?以及跨膜段5(TM5)和跨膜段7(TM7)的重新排列有關，這與在視蛋白opsin（一種活性形式的視紫紅質）中觀察到的非常相似。通過納米抗體Nb80捕獲到活性狀態下β2AR的晶體結構加深了我們對激動劑結合和激活過程的了解。

圖3. 激動劑-Nb80穩定的活化β2AR晶體結構與反向激動劑結合的β2AR的比較

反向激動劑Carazolol(黃色）與β2AR-T4L結合的結構(β2AR-Cz) 顯示為藍色。激動劑BI-167107（綠色）與Nb80穩定的β2AR-T4L結合的結構 (β2AR-Nb80)顯示為橙色。將這兩個結構經Pymol align進行對比。

A.β2AR-Nb80復合物的側視圖，Nb80的CDR1(淺藍色)和CDR3(藍色)。

B.兩種復合物結構疊加的側視圖，顯示出受體β2AR的胞內部分(G蛋白結合域）結構比較有顯著的變化。

C.受體β2AR的胞外部分(配體結合域）的比較，顯示結構變化不大。

VHH Nb35穩定GPCR-Gs的結合構象

Kobilka研究小組在2011年報道的另外一份重磅研究成果，β2AＲ-Gs的晶體結構^[3]，同樣采用了納米抗體來穩定復合物的構象，不同與Nb80(模擬G蛋白結合GPCR)，這項研究中用到的納米抗體Nb35用于結合G蛋白異源三聚體(Gs)，穩定β2AＲ-Gs復合物。從獲得的3. 2?分辨率的T4L-β2AＲ–Gs–Nb35復合物晶體結構中觀察到(圖4)，Nb35插入在Gα亞基和Gβ亞基的交匯面，其CDR1 loop與Gβ亞基相互作用，較長的CDR3 loop則同時與Gα亞基和Gβ亞基相互作用，并且Nb35的框架區也與相鄰的Gα亞基發生相互作用。

圖4. T4L-β2AR–Gs–Nb35整體結構顯示β2AR（綠色）與激動劑BI-167107（黃色）結合并與Gα橙色大面積結合。Gα與Gβ（青色）和Gγ一起(紫色)構成G蛋白異源三聚體(Gs).

Nb35參與捕獲的β2AR–Gs復合晶體結構是GPCR跨膜信號傳導的第一個高分辨率視圖，為GPCR：G蛋白復合物的形成，GTP結合以及復合物解離過程中的機制研究提供了重要的框架。深入了解GPCR：G蛋白活化的結構基礎將為藥物發現提供新的可行方法。繼這篇重磅研究之后，Kobilka教授接著對β2AR多種狀態做了構效關系的研究。除此之外，通過類似的思路，他們還對GPCR B類受體等蛋白做了結構解析。2014年，Kobilka教授實驗室發表綜述，總結了用于穩定GPCR蛋白構象的納米抗體的篩選流程^[4]。

VHHs將GPCR鎖定在可成藥構象中加速靶向藥物發現

隨著β2AR多種狀態下的晶體結構的成功捕獲，在促進人們對GPCR參與信號傳導機制理解的同時，富有想法的科學家們延續納米抗體在GPCR研究領域的優勢，并將其發展為靶向GPCR的藥物發現關鍵平臺之一。比如Confo Therapeutics公司，人員組成中不僅擁有多位Ablynx前員工，也包含參與2011年β2AR結構解析工作的科學家。

Confo Therapeutics公司核心技術平臺設計的原理是使用VHHs將GPCR以及GPCR：Gs信號轉到復合物穩定在與疾病相關的藥理構象狀態，進而篩選出更具選擇性和有效性的候選藥物分子。該公司將可穩定構象的VHHs統一命名為ConfoBodies(簡稱Cbs)，并分為三類^[5]。I型Cbs是模擬G蛋白的VHHs，它直接與激活的GPCR的胞內環相互作用，穩定活性構象(圖5，A)。II型Cbs是直接與非活化的GPCR的胞內環結合并穩定非活性構象。III型Cbs是穩定GPCR:Gs信號轉到復合物的VHHs，通過與Gs信號蛋白相互作用，間接穩定GPCR:Gs信號轉到復合物的活性構象(圖5，B)。

圖5. ConfoBodies(Cbs)的作用模式圖。

2018年Jan Steyaert研究小組 (2011年β2AR晶體結構解析工作的作者之一）發表的文章也展示了這種基于VHHs的藥物發現設計[6]。在放射性配體競爭實驗中，研究者對比活性構象的β2AR-Nb80復合物相對于基礎活性構象 (basal activity)的β2AR-Nbirr對激動劑小分子和拮抗劑小分子與受體β2AR親和力的差異（圖6）。結果顯示，G蛋白模擬物Nb80 有效地將β2AR鎖定在活性狀態構象（圖6 A）。

圖6. 放射性配體競爭實驗。激動劑、拮抗劑和反激動劑不同程度地取代了放射性標記的拮抗劑[3H]-二氫腎上腺素（[3H]-DHA）結合到受體的原始狀態(β2AR-Nbirr，closed red symbols)和活性狀態(β2AR-Nb80，open green symbols)。

(a)-(b) β2AR與Nb80結合將受體β2AR穩定在高親和力的活性狀態，與原始狀態（β2AR-Nbirr）相比，β2AR-Nb80對配體Epinephrine(腎上腺素)和Isoprotenerol(異丙腎上腺素)的結合強度提高約2000倍。

(c) Alprenonol(丙烯醇)，一種中性拮抗劑，與β2AR-Nb80和β2AR-Nbirr的結合強度相當。

(d) β2AR反向激動劑如ICI-118,551優先結合受體的基礎狀態，而不是活性狀態。

通過這種便捷的設計，研究者在納米抗體的參與下將受體β2AR穩定在活性或基礎構象狀態下，然后測量配體結合親和力的變化，可用于對多種新型激動劑進行鑒定和排序，并可進行激動劑、拮抗劑或反激動劑的功效分類。緊接著Jan Steyaert研究小組通過單點放射性配體置換試驗，對1000個小分子（分子量在80-300 Da且少于三個氫鍵供體或受體的小分子）進行篩選，檢測它們與受體的激活狀態(β2AR-Nb80復合物）和基礎狀態（β2AR-Nbirr復合物）的結合(圖7)。經這種比較篩選，發現了大量的片段優先結合活性狀態的受體（β2AR-Nb80復合物），表現出與β2AR激動劑類似的結合特性。而其他與β2AR-Nb80和β2AR-Nbirr的結合強度相當的小分子，或優先結合基礎活性狀態的小分子，則分別類似于拮抗劑或反向激動劑。

圖7. 對β2AR的激活態和基礎態進行基于小分子片段的比較篩選。每個點測量的是放射性配體([3H]-DHA）在受體激活狀上的剩余結合(X軸)，與受體基礎狀(Y軸)上的剩余結合。綠色突出顯示的小分子被選中進行表征。

接下來研究者從高選擇性結合激活態β2AR的小分子中選出3個（CC40246、CC56213和AC44411）用于評估這種生化篩選特定分子片段的方法是否可以作為設計強效激動劑的起點。為了實現結構的多樣性和覆蓋不同的拓撲學和化學空間，在計算工具的幫助下，基于選定的小分子，研究者設計出一組衍生的小分子化合物(文獻6補充材料）并進行功能評估(圖8）。

圖8. 基于CC56213設計的代表性衍生化合物BC486的功能評估。放射性配體競爭實驗和三個激動劑模式下的細胞試驗。

(a) 在使用放射性[3H]-DHA示蹤劑的配體競爭實驗中 BC486(circle)與設計它所參考的原始化合物CC56213(diamonds)功能相似，都是優先結合激活狀態的β2AR-Nb80（綠色曲線）而不是基礎狀態的β2AR-Nbirr(紅色曲線)。

(b) β2AR HitHunther cAMP assay檢測 BC486誘導的cAMP積累

(c) β2AR PathHuntherβarrestin assay檢測BC486引起的βarrestin的招募。

(d) PathHunter? Activated GPCR Internalization assay檢測BC486引起的β2AR內吞。

功能實驗顯示選出的高親和力的片段衍生化合物對 β2AR-Nb80 表現出pM親和力并且區分激活狀態與基礎狀態的親和力相差四個數量級，接近β2AR受體的全動態激活。這些片段衍生的化合物在細胞測定中也都展示出相似的功能。

小結 
GPCR作為生物體中表達和功能最廣泛的一類蛋白，是重要的藥物靶點。在GPCR結構解析和信號傳導機制研究工作中，納米抗體技術的應用起到至關重要的作用，納米抗體捕獲GPCR的功能構象狀態、特別是其活性構象狀態，從而允許對GPCR進行結構和功能分析，包括高分辨率結構分析和由其衍生的許多其他應用。目前，已有多個研究團隊將納米抗體用于建立構象選擇性片段的靶向GPCR的候選分子篩選分析和發現，以從中得到具有理想的體外藥理學和效力的分子。納米抗體成為擴展藥物發現的工具箱，將大力促進GPCR靶向性的新結構藥物的開發。

參考資料：

[1]. https://fanpusci.blog.caixin.com/archives/252858

[2]. Rasmussen. et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the β2 adrenoceptor. 

Nature 469, 175–180 (2011). https://doi.org/10.1038/nature09648

[3]. Rasmussen. et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor–Gs protein complex. 

Nature 477, 549–555 (2011). https://doi.org/10.1038/nature10361

[4]. Pardon, E., Laeremans, T., Triest, S. et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. 

Nat Protoc 9, 674–693 (2014). https://doi.org/10.1038/nprot.2014.039

[5]. Laeremans T. et al. Accelerating GPCR Drug Discovery With Conformation-Stabilizing VHHs. Front. Mol. Biosci. 9:863099(2022). doi: 10.3389/fmolb.2022.863099

[6]. Pardon, Els. et al. Nanobody-Enabled Reverse Pharmacology on G-Protein-Coupled Receptors. Angewandte Chemie (International ed. in English) vol. 57,19 (2018): 5292-5295. doi:10.1002/anie.201712581

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