前言

納米抗體由于其體積小、穩定性優良、親和力高和制備可行性強，已廣泛應用于CAR-T中作為抗原結合域?；诩{米抗體的CAR結構已經在十多個不同的腫瘤特異性靶點上顯示了良好的功能。得到的基于納米抗體的CAR-T或CAR-NK細胞在體內外均顯示出抗腫瘤效果。納米抗體在CAR-T治療中的應用已經從實驗室到床邊得到了很好的證明，并在形成更具挑戰性的先進CAR-T方面顯示出巨大的潛力。

CARs發展簡史 ^[1,2]

嵌合受體最早由Zelig Eshhar和Gideon Gross于1989年提出。他們將αβ-T細胞受體（TCR）的Vα和Vβ區域分別替換為抗體的VH和VL, 構建生成一種人工嵌合TCR，其形式可以是VH-Cα/VL-Cβ或VL-Cα/VH-Cβ，如圖2所示。這種嵌合TCR，能夠以MHC非依賴性方式結合靶細胞并通過TCR機制激活細胞。

圖1. TCR、嵌合TCR以及不同代scFv作為CAR結構域的示意圖^[2]。

現在所使用的CARs由四個組成部分組成：細胞外抗原識別結構域(包括單鏈抗體片段scFv或納米抗體VHH）；結構成分，如鉸鏈和跨膜結構域；提供維持CAR-T細胞效應器功能的共刺激信號結構域，以及CD3ζ激活域。

第一代CAR只包含CD3ζ鏈信號轉導結構域。第一代CAR-T細胞雖然在體外和小鼠模型中可以特異性地殺死靶向腫瘤細胞，但是由于腫瘤細胞很少表達共刺激受體配體如B7，而第一代CAR也不具有共刺激受體結構域，因此顯示出較低的細胞殺傷活性和體內較短的存留期，不具備臨床上的有效性。

第二代CAR在跨膜序列和CD3ξ的ITAM域之間插入共刺激域，例如CD28、4-1BB或OX40。第二代CAR-T表現出優化的T細胞激活、增加的體外抗原依賴性增殖、增強的體內持久性和更有效的抗腫瘤活性。具有CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR目前已經得到很好建立，三種FDA批準的抗CD19 CAR-T細胞都基于這種結構設計。

第三代CAR則加入額外的共刺激域以進一步增強T細胞的激活。典型胞內域由CD28/4-1BB/CD3ξ 或CD28/OX40/CD3ξ組成。臨床試驗表明，與第二代CAR相比，攜帶第三代CAR的CAR-T細胞展現出更強的擴增和更長的存活時間，尤其是對于病情輕微和正常B細胞水平較低的患者[3]。

第四代CAR添加分泌細胞因子或抗體能力，通過調節腫瘤免疫微環境以增強其抗腫瘤活性。第四代CAR-T細胞將CAR-T細胞的直接抗腫瘤功能與腫瘤部位釋放細胞因子的免疫調節能力融合在一起，避免了系統性給藥引起的細胞因子不良影響，并且有望用于實體瘤的靶向治療。

第五代CAR是基于第二代CAR設計的，在其胞內結構域添加了細胞因子受體。

圖2. 細胞免疫治療從實驗室到臨床的簡要發展歷程^[2]。

納米抗體替代scFv作為CAR的靶向結構域的優勢

無聚集風險

scFv作為CAR容易在細胞表面聚集觸發效應細胞的激活和細胞毒性信號級聯，導致T細胞枯竭。scFv高自聚集趨勢的主要原因有重鏈可變區上暴露的自由疏水殘基，和VH/VL區域不穩定性折疊。相反，基于VHH的CAR-T細胞沒有這種風險。

圖3. CAR-T表面的scFv聚集示意圖^[1]。

導致scFv聚集在CAR-T表面上的兩種機制。第一種（左）稱為VH-VL錯配，一個CAR的VL域與另一個CAR的VH域之間的配對。第二種（右）稱為VH-VH配對，一個CAR的VH域與另一個CAR的VH域發生配對。

低免疫原性

scFv結構中連接VH和VL的連接肽序列，以及鼠源抗體的骨架序列，會導致免疫原性風險，引起體內產生抗藥物抗體（ADA）。ADA效應可能會中和CAR-T細胞的功能，引起嚴重的副作用，CAR-T細胞丟失，甚至CAR-T治療失敗。與之相比，VHH不需要連接肽，并且VHH與人類VH（VH3基因家族）的序列相似性高達75-90％，因此免疫原性的風險不太可能發生。

雙特異性CAR

scFv的結構限制了構建更復雜CAR的潛力。構建雙特異性CAR時，兩個獨立scFv分子中VH和VL的交叉配對可能導致親和力降低，并且多個scFv插入基因的大小影響病毒包裝效率。VHH比容易出現錯配的scFv更有利構建為雙特異行CAR的靶向結構域，而且轉染和病毒包裝的效率也要優于scFV。

除了以上優勢之外，VHH在抗原表位結合、溶解度和穩定性方面也具有更有利的結構。由于這些特性，VHH在開發各種形式的CAR-T方面具有獨特的潛力。

圖4. scFv與VHH綜合對比。圖片來源https://doi.org/10.1186/s40364-021-00332-6

納米抗體在CAR-T治療領域的研究進展

基于納米抗體的CAR

圖5. 納米抗體作為靶向結構域的CAR-T設計示意圖

BCMA是一種跨膜激活劑和鈣調節因子，在B細胞成熟和分化成漿細胞過程中發揮重要作用。由于惡性漿細胞表達BCMA水平較高，因此成為各種癌癥免疫治療的重要靶點。傳奇生物的西達基奧侖賽(Cilta-cel，研發代號：LCAR-B38M)于2022年獲FDA批準，用于治療成人復發/難治性多發性骨髓瘤(MM)，是中國首個獲FDA批準的細胞治療產品，同時也是全球首款批準的納米抗體作為靶向結構域的CAR-T。

Cilta-cel采取獨特的二價納米抗體設計，臨床數據顯示，平均12.4個月隨訪期，總緩解率ORR高達97%，sCR高達67%，12個月無進展生存率為77%，12個月總生存率為89%。Cilta-cel的批準上市表明使用納米抗體開發和制造雙特異性/二價CAR-T細胞是可行的。

除了已獲批的Cilta-cel使用了納米抗體作為CAR-T靶向結構域外，目前，關于納米抗體CAR-T靶向結構域的研究在多個熱門靶點均有涉及，包括VEGFR2、HER2、PSMA、TAG-72、GPC2、CD38、CD33、CD7、MUC1、EGFR、CD20、CD105、PD-L1和EIIIB等。

圖6. 使用納米抗體作為靶向結構域的CAR-T靶點^[2]。

基于納米抗體的靶向模塊

UniCAR T細胞是一種基于CAR技術的改進型T細胞治療方法。與傳統CAR T細胞不同的是，UniCAR T細胞并不直接與腫瘤細胞結合，而是通過與靶向模塊結合重定向到特定的細胞表面抗原。由于納米抗體分子小，可以更容易地滲透到腫瘤組織中，制備和合成更加靈活，因此是很好的靶向模塊選擇。研究數據也表明基于雙價VHH的靶向模塊能夠將表達UniCAR的T細胞重定向到表達EGFR抗原的低水平癌細胞^[4]。

圖7. 使用基于scFv、單價VHH和雙價VHH的靶向模塊來重定向表達UniCAR的T細胞，以靶向特定的目標抗原^[1]。

自分泌納米抗體的CAR-T

目前全球已有多款CAR-T藥物獲批上市，但都是針對血液系統腫瘤，而實體腫瘤患者眾多，腫瘤局部微環境更復雜。第四代CAR-T有望通過自分泌抗體或細胞因子來調節實體瘤腫瘤免疫微環境以增強其抗腫瘤活性。其中進展最快的是上海細胞治療集團自主研發的自分泌PD1納米抗體MSLN-CAR T細胞產品（BZD1901），于今年3月份獲批臨床。該產品通過靜脈輸注給藥，回輸的CAR-T細胞在識別腫瘤抗原后被激活，通過細胞毒性作用殺傷腫瘤細胞，同時釋放PD1納米抗體，與T細胞表面PD1進行結合，阻斷PD-1/PD-L1信號，改變抑制性的免疫微環境，發揮協同作用殺傷腫瘤細胞。

小結

納米抗體是細胞治療領域中一種新興的、可塑性強的工具。與傳統單鏈抗體相比，納米抗體更容易穿透腫瘤細胞，能夠更好地識別腫瘤靶點并產生抗腫瘤效果。納米抗體還可以被用來構建多功能的CAR-T細胞，通過針對多個靶點，提高治療的療效和安全性。此外，納米抗體還可以作為UniCAR-T的靶向模塊，對CAR-T細胞進行動態調節和監測。隨著對其研究的深入，相信納米抗體在細胞治療相關應用將會越來越廣泛。

參考文獻：

[1].Safarzadeh Kozani P, Naseri A, Mirarefin SMJ, Salem F, Nikbakht M, Evazi Bakhshi S, Safarzadeh Kozani P. Nanobody-based CAR-T cells for cancer immunotherapy. Biomark Res. 2022 Apr 25;10(1):24. doi: 10.1186/s40364-022-00371-7. 

[2].Bao C, Gao Q, Li LL, Han L, Zhang B, Ding Y, Song Z, Zhang R, Zhang J, Wu XH. The Application of Nanobody in CAR-T Therapy. Biomolecules. 2021 Feb 8;11(2):238. doi: 10.3390/biom11020238. 

[3]. Ramos, C.A.; Rouce, R.; Robertson, C.S.; Reyna, A.; Narala, N.; Vyas, G.; Mehta, B.; Zhang, H.; Dakhova, O.; Carrum, G.; et al. In Vivo Fate and Activity of Second- versus Third-Generation CD19-Specifific CAR-T Cells in B Cell Non-Hodgkin’s Lymphomas.Mol. Ther. 2018, 26, 2727–2737.

[4]. Albert S, et al. From mono- to bivalent: improving theranostic properties of target modules for redirection of UniCAR T cells against EGFR-expressing tumor cells in vitro and in vivo. Oncotarget. 2018;9(39):25597–616.

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