酵母展示技術最早是由美國的Boder和Wittrup于1997年提出，他們利用酵母表面展示的原理將外源蛋白質插入到酵母表面的蛋白質上，使其能夠在酵母表面表達出來。George P. Smith等人之后對該技術進行了改進，如在1998年，Smith等人報道了一種更簡便、高效的方法來構建酵母表面展示的蛋白質庫。隨著技術的不斷改進和完善，酵母展示技術已經廣泛應用于蛋白質功能研究、藥物篩選、抗原鑒定、疫苗研發等領域。

酵母展示技術的原理

外源多肽、抗體或蛋白質等通過與酵母表面展示系統中的蛋白質進行融合表達，并使其在酵母表面高效地展示出來。該技術通常使用兩種酵母菌株：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（Pichia pastoris）。釀酒酵母通常用于表達蛋白質和抗體等，而畢赤酵母則更適合于表達復雜的糖基化蛋白質。

常用的錨定蛋白有a-凝集素、Flo1p、Yps1p、Cwp2p、Sed1p、Pir1-4等（圖2）。展示的蛋白經分泌途徑，首先被轉運到內質網腔內，然后從內質網轉運到高爾基體，最終錨定于細胞壁表面。

酵母展示系統繼承了噬菌體展示的表現型與基因型一致和易于擴增的特性，可根據編碼蛋白的特性對目的基因進行篩選。它不但可以應用傳統的生物淘洗方法進行篩選，另外由于酵母細胞體積較大，從而決定了它在篩選方法上具有特殊優勢：可用熒光激活細胞分選儀（fluorescence activated cell sorter，FACS）進行篩選。具體過程如下：將展示文庫與靶分子一起孵育，表面表達有靶分子配體的酵母細胞就會與靶分子結合，洗去未結合的靶分子。隨后加入熒光標記的抗體，洗去游離的抗體分子。將熒光標記了的細胞懸液用FACS分選表達目的蛋白的酵母。

NBbiolab酵母表面展示平臺采用“α-凝集素”展示系統，將納米抗體基因序列和表達標簽HA tag基因序列插入至蛋白質支架-Aga2基因的展示質粒載體中，該載體使用營養標記物在酵母中維持選擇性生長，并通過培養基中加入半乳糖誘導酵母進行表面展示，納米抗體融合蛋白被分泌并錨定在酵母細胞壁上。再結合磁珠及細胞分選技術進行多輪篩選，可篩選得到高親和力、高穩定性的克隆。

圖1 酵母表面展示原理

酵母表面展示技術優勢

真核表達系統：

酵母具有類似于高等真核生物的分泌途徑， 蛋白質折疊在內質網中，其中伴侶蛋白，折疊酶和質量控制機制確保僅分泌正確折疊的蛋白質。

無偏向性：

酵母展示系統采用FACS分選技術，基于抗體親和力及展示水平進行篩選，因此消除了表達引起的偏差，且能區分相差很小親和力的克隆。

精確控制篩選參數：

酵母表面展示的篩選方法與流式細胞術提供的定量和多參數分析兼容?？蓪彌_液組成、pH、溫度和抗原濃度等條件進行精確控制，實時了解展示水平及其抗原結合情況，分選在特定孵育條件下與靶蛋白結合的克隆。

基于抗體親和力及展示水平進行篩選：

通過使用多染色的 FACS，可以直接在酵母細胞表面上確定抗體親和力，從而無需耗時的亞克隆、表達和純化。

更高效獲得抗體序列：

抗體篩選速度快，3min即可完成10萬個細胞的分選，結合NGS可獲得上百條序列獨特的候選克隆。

圖2 酵母展示納米抗體發現流程

阿帕克生物酵母表面展示技術優勢

1. 高質量建庫表準，酵母庫容可達10⁸。

2. 優化信號肽，文庫表達率可達到65%~80%。

3. 與流式多色分選和NGS測序強力組合。

參考資料：

1. Chao G, Lau WL, Hackel BJ, et al. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nature Protocols. 2006;1(2):755-768. doi:10.1038/nprot.2006.9.

2. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nature Biotechnology. 1997;15(6):553-557. doi:10.1038/nbt0697-553.

3. Bidlingmaier S, Liu B (2011) Construction of yeast surface-displayed cDNA libraries. Methods Mol Biol 729:199–210. doi: 10.1007/978-1-61779-065-2_13.

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