2014年洛克菲勒大學大學Fridy等人開發并優化了一種名為Nano MiSeq/MS的新技術，該技術將二代測序（NGS）與質譜相結合，以快速生成大量具有高親和力和特異性的納米抗體。

Fig.Overview of nanobodies produced by high-throughput sequencing and mass spectrometric identification.

該方法基本流程是分離免疫美洲駝的骨髓淋巴細胞，擴增VHH片段，并高通量DNA測序，獲得VHH蛋白質數據庫，并結合質譜（MS）鑒定源自同一動物血清的VHH片段。基于質譜的數據在VHH蛋白數據庫中進行匹配，從而獲得VHH序列信息。

在這種方法中，Fridy依據protein A和protein G對HCAb與傳統抗體（IgG1）親和力的不同，在美洲駝免疫后將含VHH的HCAb在血清中進行連續分級（Hamers-Casterman等，1993）。然后將HCAb在抗原偶聯的樹脂上進行親和純化，為了獲得高親和力VHH片段，嚴格控制洗滌條件，并在樹脂上用木瓜蛋白酶消化，以裂解掉恒定區，洗滌后回收VHH片段。將回收后的高親和力VHH片段采用胰蛋白酶消化和凝膠純化，并通過LTQ-Velos-Orbitrap質譜分析。為創建抗原特異性的VHH序列蛋白數據庫，從免疫后的美洲駝分離淋巴細胞，并提取RNA與合成cDNA。采用巢式PCR特異性擴增編碼VHH區的序列，以進行高通量測序。 他們同時開發了Llama Magic web server，利用計算機輔助快速搜索并匹配VHH序列。以GFP與mcherry為抗原進行驗證，針對GFP 共獲得25條VHH序列，mcherry 獲得5條VHH序列，經過SPR驗證，抗體親和力都在幾十nM~pM之間。利用同樣的方法，Shi Yi教授團隊^2,3發表了多篇文章，證明了此方法高效與高通量。利用這項技術，作者確定了數千種高親和力anti-HSA NBs（NbHSA）。在這項研究中，作者制作并系統地描述了一系列用于藥物輸送的結構多樣和亞納米親和性NBHSA。通過定量蛋白質組學開發了一種多重藥代動力學分析方法，并測定了幾十種被挑選出的NBHSA在Alb-/- FcRn人源化小鼠模型的半衰期。

實驗結果表明，在HSA模型中，NBHSA具有不同的藥代動力學特征，半衰期從1.6天到7.6天不等。在弱酸性pH下，NbHSA的半衰期與其白蛋白結合親和力呈正相關。為了證明NBHSA的效用，作者通過將幾種跨物種的NBHSA與人白細胞介素-2融合，產生了“Duralukin”。Duralukin可以從大腸桿菌細胞中快速產生，具有良好的穩定性和生物活性。利用黑色素瘤小鼠模型，作者證明了Duralukin對癌癥治療的高臨床前療效。

基于質譜的納米抗體開發，雖然具有非常高的通量，能夠通過控制洗脫條件（如高，低pH，鹽離子濃度等）獲得高親和力納米抗體，但這種方法只對簡單的大分子比較高效，對于多次跨膜蛋白來說，篩選效率低。其次成本高，需要配備質譜，二代測序儀等昂貴儀器，難度系數大，操作復雜，不僅需要對血清進行純化，獲得特異性多抗外，還需要質譜與NGS分析，工作量巨大。最后獲得序列信息后，不能夠與表型統一，需要基因大量合成與表達驗證，時間周期長，成本高，因此該方法在業界并未大量使用。

參考文獻：

1. Fridy, P., Li, Y., Keegan, S. et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Methods 11, 1253–1260 (2014). https://doi.org/10.1038/nmeth.3170.

2. Xiang Y, Sang Z, Bitton L, Xu J, Liu Y, Schneidman-Duhovny D, Shi Y. Integrative proteomics identifies thousands of distinct, multi-epitope, and high-affinity nanobodies. Cell Syst. 2021 Mar 17;12(3):220-234.e9. doi:10.1016/j.cels.2021.01.003.

3. Yufei Xiang et al., (2020), Versatile and multivalent nanobodies efficiently neutralize SARS-CoV-2, Science, DOI: 10.1126/science.abe4747.

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