前言  

目前較為常見的用藥方式有五種：口服、注射、吸入（治療哮喘的藥）、局部用藥（各種膏藥）和滴鼻。其中以口服和注射最為常見。那么藥物從進入人體到消耗殆盡需要多長時間呢？這時就要引入半衰期這個概念了。半衰期就是從注射完畢開始算起，到血漿內藥物剩一半所需要的時間。請注意，談到半衰期，都是指“血漿內”的藥物濃度。常規抗體通常半衰期較長，因為分子量較大，而且能夠特異性地和FcRn結合（圖1），而FcRn能夠保護抗體不被溶酶體降解，抗體隨FcRn轉運至細胞膜表面后失去與FcRn的結合，重新釋放進入血漿，從而延長了抗體的半衰期^[1]。與常規抗體相比，納米抗體最大的短板是血漿內的半衰期非常短，雖然這使得其在體內成像方面大展身手，但限制了其在治療領域的應用。因此，如何提高納米抗體的半衰期是納米抗體在體內應用的一大瓶頸。

圖1. FcRn對IgG代謝的調控機制

納米抗體的半衰期

自從1993年首次報道以來，大量的研究表明納米抗體具有很好的應用前景，尤其是在很多疾病的診斷和治療方面，納米抗體都有著不俗的表現。然而對于蛋白藥物來說，腎小球的濾過界限一般在60kDa左右。也就是說小分子量的抗體片段或衍生物，例如納米抗體（15kDa）和scFv（28kDa）甚至Fab（50kDa）都會通過腎小球的濾過作用從體內清除，導致其擁有較短的半衰期。其中，納米抗體在所有抗體類型中分子量最小，半衰期往往只有幾十分鐘。

圖2. 不同形式的抗體的結構及分子量

常用的納米抗體半衰期延長方案

目前關于納米抗體延長半衰期的方法主要有以下幾種方式：①通過偶聯聚乙二醇（PEG）的方法提高蛋白自身的分子量。②將納米抗體直接與抗體Fc區相連成融合蛋白。③將納米抗體與抗HSA的納米抗體串聯；④多個納米抗體串聯形成多價和多特異性納米抗體。就目前已上市和在研的納米抗體藥物來看，大多是選擇將納米抗體和Fc或者人血清白蛋白HSA融合這種方式來彌補半衰期短的問題，接下來就這兩種方式詳細介紹原理和效果。

納米抗體與HSA結合

1. HSA的特點

HSA的X射線晶體結構顯示，它是一個心形分子，含有585個氨基酸，它主要由α -螺旋結構構成，缺乏β -折疊，組合成三個同源域DI, DII和DIII，其中每個被分為A和B子域 (DIA, DIB, DIIA, DIIB, DIIIA和DIIIB)，這些域由長而柔性的環連接^[3]。

圖3. 白蛋白的三維結構

HSA是人體血漿中含量最豐富、結構最穩定的蛋白質，其濃度約為45 mg/ml (0.6 mM)，循環半衰期長達20天。納米抗體與HSA結合后（圖4），流體力學半徑和分子量增加，腎小球過濾減少，體內滯留時間將大大延長；同時借助FcRn介導的再循環作用，半衰期可由數小時延長至3周以上。

圖4.白蛋白-納米抗體非共價結合復合體示意圖 

2. 納米抗體與HSA結合

引入抗HSA的VHH，介導藥物與HSA的結合可以有效提高藥物的半衰期。目前已經報道了一系列基于抗腫瘤抗原、抗CD16和抗HSA納米體的雙特異性納米抗體。其中由Ablynx開發的人源化、三價的雙特異性納米抗體Ozoralizumab于2022年9月在日本獲批（英文商品名：Nanozora^?），這也是全球首款獲批上市的雙特異性納米抗體。Ozoralizumab含有3個納米抗體結構域，其中2個靶向TNF-α，1個與HSA結合延長藥物半衰期，單次給藥后平均半衰期t1/2為18.2天。

圖5.Ozoralizumab結構示意圖

另外，君實生物自Anwita Biosciences引進的JS014是一款創新納米抗體，其活性成分為重組白介素21-抗人血清白蛋白（HSA）納米抗體融合蛋白， JS014 高親和力特異性地結合人 IL-21R 并激活淋巴細胞，通過融合抗 HSA 的單域抗體使 IL-21 的半衰期得到顯著延長。目前JS014正在開展晚期惡性腫瘤的臨床試驗。

納米抗體偶聯抗體Fc片段

1. 抗體Fc片段的結構和功能

抗體Fc片段是抗體的恒定區，在這個恒定區域內氨基酸的序列在不同的抗體中呈現相同的狀態，抗體的不同類型，由抗體FC片段的特異性結構來進一步決定。納米抗體除了半衰期短，由于缺乏單克隆抗體的Fc片段，不具備Fc介導的效應功能，如抗體依賴的細胞介導的細胞毒（ADCC）效應和血清穩定性。自然殺傷細胞（NK）是介導ADCC作用的主要免疫細胞，其細胞表面的Fc受體FcγRIIIa（CD16a）在識別和結合Fc中起關鍵作用。

2. 納米抗體偶聯Fc片段的研究

納米抗體可以很容易偶聯Fc片段重組人源化重鏈抗體形式，以實現包括Fc介導的效應因子功能，并增加血液滯留時間，但也將不可避免地降低其擴散優勢。選擇Fc融合片段，更傾向于選擇IgG1 Fc，這和IgG1與Fc受體蛋白的親和力結合特性有關。

2.1 康寧杰瑞KN035

應用Fc融合技術最成功的納米抗體藥物當屬康寧杰瑞的恩維達^?（KN035）。這是康寧杰瑞自主研發的PD-L1單域抗體Fc融合蛋白，也是全球第一個獲批上市的皮下注射PD-(L)1抗體，適用于不可切除或轉移性微衛星高度不穩定（MSI-H）或錯配修復基因缺陷型（dMMR）的成人晚期實體瘤患者的治療^[9]。KN035的PD-L1結合分子中包含免疫球蛋白Fc區可以使所述結合分子形成二聚體，同時延長所述分子的體內半衰期，約為200小時。

圖7. KN035的晶體結構

2.2 復宏漢霖HLX53

2022年12月9日，復宏漢霖宣自主開發的創新型抗TIGIT的Fc融合蛋白（由納米抗體和野生型 IgG1的Fc端組成）在晚期/轉移性實體瘤及淋巴瘤患者中開展的I期臨床試驗（NCT05394168）完成首例受試者給藥。臨床前研究結果表明，HLX53具有優異的腫瘤抑制效果且安全性良好^[11]。目前，全球范圍內尚無同類抗TIGIT的Fc融合蛋白藥物獲批上市。

圖8. HLX53的抗體結構和作用機制

納米抗體 PEG化

1. 什么是PEG？

聚乙二醇（PEG）是一種以-CH2-CH2-O-為重復單元的水溶性的聚醚，其結構圖如圖9所示，在常溫下，根據分子量的不同，PEG會從黏流的液體到版結晶的固體。PEG具有很低的免疫原性/抗原性和毒性。PEG化修飾（PEGylation）是將PEG共價結合在藥物上，以改善藥物的藥代動力學、藥效學和免疫學特性，從而增強其治療效果的一種藥物技術。PEG化修飾會改變藥物的物理化學性質，包括構象、靜電結合、疏水性等。這些物理和化學變化增加了藥物的體內保留時間，提高血漿半衰期，延長吸收時間，還能影響藥物與細胞受體的結合親和力，改善腫瘤靶向性。藥物經PEG修飾后可減少給藥次數、提高療效、改善耐受性、降低嚴重程度和不良事件發生率。同時PEG還可以增加蛋白質的溶解度和穩定性，有利于藥物的生產和儲存。因此PEG常被用作藥物傳遞和藥物修飾技術，可以直接與藥物偶聯，或附著在藥物表面一起封裝于納米材料里。

圖9. 代表性的PEG結構

2. 納米抗體PEG化研究

ATN-192 是Ablyx 在Ozoralizumab 基礎上開發的一種第二代TNFα 納米抗體，即PEG修飾的長效版本，目前已經完成臨床一期。 

其他提高納米抗體半衰期的策略

1. 多價納米抗體

科望生物第二款抗體藥OX40抗體ES102的臨床試驗申請獲得NMPA受理。ES102是繼信達生物IBI101、麗珠單抗、恒瑞醫藥SHR-1806之后第4款申報臨床的OX40抗體。ES102是一種六價納米抗體的Fc融合蛋白（圖10）。其獨特設計使得ES102即便在沒有外源性交聯的情況下也能強效激活OX40通路。據悉，與傳統的二價或四價OX40抗體相比較，ES102具有很強的免疫激活能力，并且已經在臨床前顯示出顯著的單藥及聯合免疫檢查點抑制劑PD-1/PD-L1抗腫瘤藥效，同時在臨床前安全性評價中也展現了良好的安全性特征。目前， ES102正在開展其在臨床I期試驗。

圖 10. ES102的抗體結構

2. 納米抗體偶聯鐵蛋白“Fenobody”

將納米抗體展示在鐵蛋白表面，利用鐵蛋白亞基的自組裝特性而形成的一種籠狀蛋白殼。鐵蛋白是一種由24個亞基自組裝形成的外徑為12納米、內徑為8納米的籠狀蛋白。在該工作中，研究人員利用基因工程手段將納米抗體連接到鐵蛋白亞基的C端。結果表明，自組裝的鐵蛋白亞基成功將納米抗體以24聚化的形式展示在一個鐵蛋白殼表面。

研究人員通過電鏡觀察Fenobody，發現納米抗體以4個一簇、一共6簇的形式展示在鐵蛋白表面，而且成簇的納米抗體在空間結構上能夠很靈活地暴露抗原結合位點。展示納米抗體后的Fenobody尺寸增大為21 nm，與抗H5N1納米抗體相比，Fenobody對H5N1抗原的表面親和力提高了360倍。他們還在小鼠實驗中發現，對比納米抗體，Fenobody的體內循環半衰期延長了10倍以上。同時，Fenobody在大腸桿菌表達系統中可溶性高效表達，并且具有極好的熱穩定性，Tm值達到80攝氏度以上^[12]。

圖11. Fenobody的結構和體內半衰期

小結  

納米抗體因分子量小，半衰期非常短，限制了其臨床應用。目前，已經有很多方法可以有效改造以延長半衰期， 其中包括Fc融合、PEG化、白蛋白融合及多價納米抗體融合等方法，部分方法已經取得臨床獲批或在臨床試驗階段。相信未來還會有更多科學有效的方法出現，也希望能有更多的納米抗體藥物推向臨床并且上市，推動人類健康事業的發展。

參考資料：

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[9] Fei Zhang., et al., Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immunecheckpoint blockade ,Cell Discovery 3(2017)

[10] 針對程序性死亡配體（PD-L1）的單域抗體及其衍生蛋白，專利CN201510465481.8

[11] Botong Hua, Ming Yang, Jie Xue, Chen Dong, Yi-Ting Mao, Ou Li, Eric Cheung, Hassan Issafras, Wenfeng Xu, Weidong Jiang; Abstract 2451: A novel single domain antibody targeting TIGIT for cancer use in combination therapies. Cancer Res 1 July 2021; 81 (13_Supplement): 2451.

[12] Kelong Fan., et al., Fenobody: A Ferritin-Displayed nanobody with High Apparent Affinity and Half-Life Extension. Anal. Chem., 2018, 90, 5671, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b05217

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