前言

近年來，合成納米抗體庫在篩選出高質量納米抗體方面取得了顯著進展，這在大量引用文獻中得到了充分體現。本文介紹四個引用高頻的合成納米抗體庫的設計策略，并探討其在構建和驗證過程中所采用的不同方法。

NaLi-H1 噬菌體展示文庫 ^[1]

Moutel等人（2016年）報道了第一個完全合成的人源化羊駝單域抗體噬菌體展示庫（NaLi-H1）。該庫選用優化的人源化單域抗體（hs2dAb）為支架，具備高度多樣化，能夠無需動物免疫即獲得高親和力的結合物。NaLi-H1針對多種靶標進行了篩選，包括熒光蛋白、肌動蛋白、微管蛋白、p53、HP1以及活性RHO GTP酶的構象抗體，突顯了該庫在治療應用中的潛力。

框架序列選擇和驗證：

1. 篩選高度穩定的天然納米抗體，并將其碳末端與HA標記的氯霉素乙酰轉移酶(CAT)融合。

2. 通過大量抗生素環境下菌株的生長情況來評估融合納米抗體的功能性。

3. 選擇一個最優框架序列(sdAbD10)，并設計人源化版本(hs2dAb)。將這兩種框架分別與Anit-lam1 VHH的CDR嫁接，驗證其穩定性和功能性。

CDR設計：

1. CDR1和CDR2長度固定為7個氨基酸，氨基酸序列的選取模擬自然的多樣性。

2. 降低疏水性氨基酸出現概率，減少聚集傾向。

3. CDR3完全隨機化，長度覆蓋9、12、15和18個氨基酸。

文庫構建：

采用三核苷酸DNA組裝法合成納米抗體基因，插入改造后的質粒中，轉化到TG1大腸桿菌菌株。構建出含有約30億個重組克隆的文庫，無效克隆率約為4%。

文庫驗證：

隨機選取24個克隆，檢測其溶解性和熱穩定性，在被加熱到90°C后，其中70%的克隆能夠恢復其溶解性。針對多種特性不同的抗原(如mCherry、EGFP、Tubulin、β-actin、p53、HP1α、RhoGTPase等)篩選出高親和力的特異性納米抗體，并證明其在細胞質內的結合功能。通過亞細胞定位抗體篩選，獲得了能特異性識別HER2細胞表面區域的納米抗體。所得納米抗體的親和力范圍從50pM到10nM，與免疫法或親和力成熟獲得的水平相當。

酵母表面展示合成納米抗體庫 ^[2]

McMahon等人（2018）報道了一種新的合成納米抗體庫，該庫采用基于結構的方法進行設計。該工作的重點是開發了酵母表面展示的體外納米抗體篩選平臺。

框架設計：

框架結構來自羊駝基因IGHV1S1-IGHV1S1S5的共識框架。

CDR設計：

1. CDR設計旨在重現現有納米抗體晶體結構中觀察到的氨基酸自然多樣性。

2. CDR1中4個位點和CDR2中1個位點進行了全面隨機化。

3. 對于CDR3，采用了3種不同長度(7、11、15個氨基酸)進行全面隨機化。

文庫構建：

采用兩步疊加和延伸PCR(OE-PCR)方法構建基因文庫。最終構建的酵母展示文庫的庫容約估為1×10⁸。對480,000個獨特序列的分析證實了隨機化位置的頻率和變異性符合預期。使用了一個649個氨基酸的連接肽，包括N端工程化的配偶因子α前體蛋白和C端的GPI錨定序列。大多數用于分析的納米抗體顯示出高產量(>20 mg/L)。

文庫驗證：

功能驗證通過選擇針對四類不同抗原的納米抗體來進行：2種溶性蛋白(人血清白蛋白和人脂聯素)和2種膜蛋白(β2AR和A2AR)。獲得了一種對人血清白蛋白高度特異的納米抗體，但親和力較低(430nM)。獲得了幾種特異針對β2AR和A2AR活性、拮抗劑結合構象的納米抗體，親和力在44-151nM之間。

Concave, loop, and convex文庫^[3]

Zimmermann等人（2018年）基于對納米抗體晶體結構的結構分析，特別是對CDR3長度的研究，發現短的CDR3（6個氨基酸）形成凹形表面，中等長度的CDR3（12個氨基酸）表現出“環”的突起，而較長的CDR3（16個氨基酸）則呈現凸形表面?；谶@一研究，他們選擇了幾種先前報道的納米抗體作為模板，為每種結合表面形狀構建一個合成文庫。

框架設計：

基于這些觀察，研究者從先前報道的納米抗體中選出適應每種結合形狀的納米抗體作為框架模板。為了驗證這些框架的穩定性，在隨機化的位置上生成了絲氨酸和蘇氨酸突變體，保持疏水核心和施加構象限制的氨基酸（如脯氨酸）不變。結果顯示，突變體納米抗體的熔點（Tm）相比其前體顯著提高了21–35°C。

CDR設計：

1. 針對CDR區域采用了不同的三核苷酸混合物，以平衡帶電、極性、芳香族和非極性氨基酸，調整整體的疏水性。這樣可以降低選擇膜蛋白時粘性結合體的富集，并減少聚集的可能性。

2. 三種庫的理論多樣性分別為凸面庫8.3×10^17、環狀庫4.3×10^19和凹面庫2.8×10^22。

文庫構建：

通過組裝PCR生成含有CDR的DNA片段，然后采用Type IIS限制酶進行兩步連接構建三個文庫。使用核糖體顯示技術表達這些文庫，該方法允許更大的文庫規模(9×10¹²)。

文庫驗證：

針對4種不同抗原(MBP、ABC轉運蛋白TM287/288、ENT1和GlyT1)進行了驗證。從各個文庫中篩選到了針對轉運蛋白親和力達0.5 nM的納米抗體。對TM287/288的選擇過程進行了優化，得到了親和力達2nM的納米抗體。針對GlyT1和ENT1等難靶標，也成功篩選到了高親和力的納米抗體。這些結果表明合理設計的CDR和包含多種CDR3長度，是獲得針對各種抗原的高親和力合成納米抗體的有效策略。

CeVICA文庫 ^[4]

Chen等人（2020年）基于1030個Nbs序列和298個晶體結構分析,開發了CeVICA（無細胞VHH鑒定與聚類分析）平臺。該平臺結合了合成納米抗體庫、核糖體展示以及通過CDR定向聚類分析進行的計算預測。與先前的研究不同，這項工作不僅設計了合成納米抗體庫，還將體外親和力成熟整合進入計算。

框架設計：

1. 設計了由不同版本的框架段組成的組合框架，包括3個版本的frame1、1個版本的frame2、3個版本的frame3和1個版本的frame4。

2. 這些框架的版本分別源自：從分析的天然Nb集合中提取的共識序列；天然Nb A310；一種與GFP結合的納米抗體。

CDR設計：

1. CDR長度的選擇與以前的研究略有不同，分別為CDR1包含7個氨基酸、CDR2包含5個氨基酸、CDR3包含6、9、10或13個氨基酸，這些長度與天然Nb中觀察到的最常見CDR長度相匹配。

2. 在所有隨機化位點使用了所有氨基酸，包括半胱氨酸。

文庫構建：

使用核糖體展示技術獲得了3.7 × 10¹¹個完整序列的多樣性文庫。

文庫驗證：

通過三輪篩選，分別獲得了針對EGFP和SARS-CoV-2 spike蛋白受體結合域(RBD)的納米抗體。

基于CDR相似性對獲得的納米抗體進行聚類分析，排除了針對兩種抗原的共同結合體。在16個獲得的納米抗體中，3個為強結合，8個為弱結合，3個為非結合。6個納米抗體(3個強結合、3個弱結合)在使用SARS-CoV-2 Spike假病毒的中和實驗中顯示>30%的抑制作用。經過體外成熟化過程，最強的中和抑制劑的IC50達到62.7nM，與在人類患者中發現的抗體相當。

小結

在過去的二十年中，合成納米抗體庫在一個由免疫庫主導的領域中逐漸占據了一席之地，目前已有一個合成庫（NaLi-H1）被商業化應用。這些庫的成功案例展示了合成方法在生成具備高親和力和穩定性的納米抗體方面的巨大潛力。隨著研究的不斷深入和技術的持續優化，預計合成納米抗體庫在未來的醫學診斷和治療中將扮演越來越重要的角色。

參考文獻：

[1]. Moutel S, Bery N, Bernard V, Keller L, Lemesre E, de Marco A, Ligat L, Rain JC, Favre G, Olichon A, Perez F. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 2016 Jul 19;5:e16228. doi: 10.7554/eLife.16228.

[2]. McMahon C, Baier AS, Pascolutti R, Wegrecki M, Zheng S, Ong JX, Erlandson SC, Hilger D, Rasmussen SGF, Ring AM, Manglik A, Kruse AC. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6.

[3]. Zimmermann I, Egloff P, Hutter CA, Arnold FM, Stohler P, Bocquet N, Hug MN, Huber S, Siegrist M, Hetemann L, Gera J, Gmür S, Spies P, Gygax D, Geertsma ER, Dawson RJ, Seeger MA. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 2018 May 24;7:e34317. doi: 10.7554/eLife.34317.

[4]. Chen, X., Gentili, M., Hacohen, N. et al. A cell-free nanobody engineering platform rapidly generates SARS-CoV-2 neutralizing nanobodies. Nat Commun 12, 5506 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25777-z

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