前言

過去30年間，納米抗體（Nbs)的研究迅猛發展。雖然大多數Nbs是經駱駝科動物免疫后篩選獲得，但近年來構建的合成納米抗體庫在親和力和穩定性方面展現出了生成高質量納米抗體的潛力，這種合成方法相比使用動物具有獨特的優勢。本期內容介紹合成納米抗體文庫在設計過程中的考量因素。

合成文庫的優勢與局限

優勢：

1. 無需動物免疫。

2. 適用于免疫原性弱或有毒的靶標。

3. 可多項目共用一個合成文庫。

4. 獲得抗體周期更短。

5. 框架區具有優化的物理化學性質。

局限：

1. 需要大型文庫。

2. 親和力可能低于免疫文庫。

3. 框架區和可變區的組合存在穩定性或可溶性較低的可能性。

框架選擇

Saerens及其同事們在合成納米抗體庫的發展中做出了開創性貢獻，設計并驗證了第一個“通用”框架cAbBCII10，源自針對β-內酰胺酶II的Nb。該框架因其高穩定性、在細菌中的良好表達能力以及在缺乏典型二硫鍵的情況下仍能保持功能，至今廣泛應用于新合成庫的設計中。

近年來，研究人員開發了新的策略來獲取高度穩定的框架。這些框架不僅能夠支持各種CDR長度，在還原性環境（如細胞質）中也能發揮功能，同時還實現了人源化，而不會失去溶解度、穩定性或親和力。

Nb框架選擇時需要考慮的因素：

· 框架設計策略：可基于不同Nb集合的共識序列，但結果需經全面實驗驗證。

· 溶解性和穩定性：良好的溶解性避免高分子聚集物形成，穩定的熔解溫度對各種化學反應至關重要。

· 二硫鍵引入：非典型二硫鍵可顯著增強穩定性，但可能影響表達水平，需針對性解決。

· 細胞表達水平：選擇高表達的框架對于實驗室和大規模生產都至關重要。

· 免疫原性：Nb框架人類化可降低免疫原性，尤其適用于治療應用和人體內成像。

圖1 合成文庫的設計策略和期望的物理化學特性

框架區的優化設計

框架區是納米抗體的骨干，決定其穩定性和溶解性。優化策略包括：

1. 選擇高穩定性序列：挑選具有出色熱力學穩定性的天然納米抗體序列。

2. 引入親和性增強突變：在框架區序列中引入有利于提高親和力的突變。

3. 優化codon使用：根據宿主細胞的偏好調整序列，提高蛋白表達水平。

這些設計確保了框架區的優異性能，為后續CDRs優化奠定基礎。

CDR區設計

CDR區的設計基于每個環的長度引入的不同設計。通常情況下，CDR1和CDR2的長度保持在5到8個氨基酸之間，而CDR3的長度則在6到18個氨基酸之間變化。設計中常見的策略是將CDR1和CDR2固定為特定長度，而CDR3可以設計為幾種不同長度。

在大多數情況下，CDR1和CDR2的設計遵循部分或完全隨機化的原則，以重現天然抗體庫中的氨基酸多樣性。相比之下，CDR3的常見做法是對每個位置進行完全隨機化，允許所有20種天然氨基酸的出現，但通常會排除半胱氨酸，以避免二聚體形成、聚集或折疊問題的出現。

氨基酸的隨機化通常通過使用簡并密碼子來實現。例如，NNS或NNK簡并性編碼可以涵蓋20種天然氨基酸的總共32種密碼子。盡管這種方法經濟實惠，但其缺點是可能出現終止密碼子，導致截斷的無功能分子的產生。此外，高度的密碼子冗余可能導致某些氨基酸的偏向。為了精確控制隨機化，減少不需要的氨基酸出現的可能性，有時會采用精確但成本較高的三核苷酸DNA組裝方法。這種方法的主要優勢在于可以精確地編碼所需的氨基酸，從而在每個位置上實現精確控制的隨機化。

表達系統

合成納米抗體庫構建中一個關鍵問題是選擇合適的表達系統。目前，噬菌體展示是最常用的系統，其他系統包括核糖體展示和細胞展示（如酵母、哺乳動物細胞或細菌展示）。這些系統在實驗復雜性和允許庫規模方面各有特點。

核糖體展示庫能夠提供極大的多樣性，達到10^12數量級，但操作復雜，需要經驗豐富的實驗操作技術。噬菌體展示系統的庫規模約為10^9數量級，相比核糖體展示小三個數量級，但其操作簡便靈活，因此在科研中廣受歡迎。酵母展示庫的容量約為10^8，其優勢在于可以通過流式細胞術對克隆進行篩選。每種表達系統都有其獨特的優勢和限制，研究人員需要根據具體需求和實驗條件選擇最合適的系統。

理論多樣性與實際多樣性

豐富多樣性是合成庫設計的關鍵，理論上恰當的框架選擇和精細的CDR設計可以篩選出穩定且高親和力的納米抗體。然而，實際構建的庫的多樣性遠遠低于理論值。若20個CDR位點進行完全隨機化，理論組合數是20^20，約為10^26。而實驗上能獲得的最大獨特序列數約為10^12，兩者之間差了14個數量級。盡管通過定制隨機化策略可以縮小這一差距，但理論庫與實際庫的多樣性差異仍然很大。這意味著，即使用相同的CDR設計多次構建庫，每次得到的子庫都會有所不同。此外，即便使用天然存在的氨基酸進行隨機化，也無法完全模仿天然庫的特性，因為天然庫的多樣性不僅取決于每個位置的氨基酸類型，還包括這些氨基酸組合形成的整體結合位點的復雜性。

小結

免疫庫一直是納米抗體的主要來源，然而，隨著合成庫不斷證明其作為穩定、高親和力納米抗體替代來源的價值，且成本更低，速度更快，這種情況可能會有所改變。下期內容將介紹已報道的多種合成納米抗體庫，并討論它們在構建和驗證中所采用的不同方法。

參考文獻：

Valdés-Tresanco, M.S.; Molina-Zapata, A.; Pose, A.G.; Moreno, E. Structural Insights into the Design of Synthetic Nanobody Libraries. Molecules 2022, 27, 2198. https://doi.org/10.3390/ molecules27072198

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