前言

噬菌體展示技術以其獨特的優勢在生物技術領域取得了顯著進展。本指南詳細解答從構建文庫到篩選抗體的技術實施中常見問題。通過優化輔助噬菌體選擇、提高展示和轉化效率、設計高質量引物，以及采用適當的抗原呈遞和篩選策略，研究人員可以顯著提升文庫質量和篩選成功率。同時，避免篩選到非特異性抗體的方法和措施，進一步保證了篩選結果的可靠性和實用性。

Q1. 噬菌體單價展示的本質與目的？

A. 在噬菌體展示技術中，通常使用含有pⅢ噬菌粒展示載體的輔助噬菌體感染大腸桿菌以制備噬菌體顆粒。這些顆粒中的融合蛋白表達呈泊松分布，約90%的顆粒僅展示野生型pⅢ蛋白，少于10%的顆粒展示一個融合蛋白拷貝，展示多個拷貝的情況極少。因此，大多數展示融合蛋白以單價形式存在。

單價展示與多價展示相比，單價展示在篩選過程中，可以去掉弱結合的抗體。而多價展示由于存在avidity 效應，會把弱結合的克隆也富集出來。

Q2. 常見輔助噬菌體差異與選擇

A. 含全長gⅢ的輔助噬菌體：

M13KO7、R408、VCSM13為含全長gⅢ的輔助噬菌體，也是最標準最常用的一類輔助噬菌體。M13KO7是M13噬菌體的一個突變體，帶有一個質粒復制起點，卡那霉素抗性基因以及G6125T的突變基因Ⅱ。VCSM13是M13KO7的一個突變體。R408是f1噬菌體的一個突變體，帶有一個IRI的突變并且不帶抗生素抗性標記基因，刪除了其IG中的24bp的區段從而使其包裝帶有完整信號的單鏈DNA優于其自身單鏈DNA。使用這些含有全長gⅢ的輔助噬菌體超感染后產生的輔助噬菌體和重組噬菌粒顆粒的滴度高，目的蛋白的特異性強，但是由于這些輔助噬菌體基因組不具有包裝信號，展示水平也較低，可能會導致篩選特異性陽性克隆失敗。 

gⅢ刪除的輔助噬菌體：

M13MDD3.2、R408d3、VCSM13d3是通過分別刪除輔助噬菌體M13KO7、R408、VCSM13的gⅢ（1579-2851）而構建的，再使用攜帶gⅢ的輔助質粒提供pⅢ蛋白。這就使得噬菌體組裝時，pⅢ的唯一來源僅是由噬菌粒編碼的融合蛋白，由于絲狀噬菌體的pⅢ蛋白有3-5個拷貝，這在一定程度上提高的噬菌體的展示水平，但所展示蛋白的平均親和力降低了，而且這種輔助質粒在一定程度上會造成污染，這就嚴重限制了刪除gⅢ的輔助噬菌體的使用。

gⅢ缺陷的輔助噬菌體：

hyperphage是最近由Rondot S等人從M13KO7基因組中刪除gⅢ的開放閱讀框（ORF)，僅保留啟動子和信號肽，并在信號肽后加一個短肽，同時構建大腸桿菌細胞包裝系（DH5α/pⅢ）來提供pⅢ蛋白的，這就避免完全刪除gⅢ帶來的極性效應和污染的情況，提高了噬菌體產量，也使hyperphage的滴度大大提高。CT輔助噬菌體是刪除了VCSM13基因組上gⅢ的具感染力的N1和N2區而保留CT區，用輔助質粒pUC19-gⅢ提供pⅢ蛋白。由于缺乏負責感染的N1和N2區，因此CT輔助噬菌體援救的重組噬菌體必須嵌入融合蛋白，才具有感染性。

輔助噬菌體Ex-phage、Phaberge、Ex12和VCSM13N1都在gⅢ中引入了琥珀終止密碼子，從而提供包裝效率。

Q3. 構建高質量噬菌體文庫的要點

A. 構建高質量展示文庫需要從以下5個方面進行考慮：

①PBMC 總數（理論庫容）

PBMC是文庫的關鍵，其總數決定了我們需要構建文庫的大小規模，同時也決定了文庫的多樣性。

②RNA 的質量

 使用試劑盒提取RNA，確保高純度。

③抗體多樣性（germline 分布）

抗體多樣性是指引物能不能很好的覆蓋物種的germline分布，需要注意的地方是引物的設計與引物合成的質量。

關于引物的設計a.可以根據germline的序列進行設計 b.需要考慮germline的表達豐度 c.盡量不要采用簡并引物，容易出現偏向性

關于引物的質量：我們發現國內的一些大廠為了追求方便與利潤，你要求PAGE或者HPLC純化，他們基本都是脫鹽，大家拿到引物后一定要先進行測試。

④轉化子總數（library size）

轉化子總數決定了庫容的大小，一般要求庫容量是理論多樣性的10到100倍。需要注意的是轉化子的總數不等于文庫的多樣性。

⑤背景克隆比例

背景克隆是指沒有插入片段的克隆與讀碼框錯誤的克隆，這類克隆生長速度遠遠超過插入正確片段的克隆，導致文庫質量降低。因此需要提高文庫的插入率與提高引物的質量。

Q4. 如何提高文庫展示效率

A. 前面介紹到采用M13KO7的展示效率一般比較低，大約只有10%的噬菌體顆粒展示了抗體，90%都沒有展示。提高展示效率的方法包括添加誘導劑如IPGT誘導表達；或更換展示效率更高的輔助噬菌體如hyperphage 與Ex-phage等。

Q5. 如何提高大腸桿菌轉化效率

A. 選擇高效率的電轉感受態細胞，能有效的提高大腸桿菌轉化效率從而增加噬菌體文庫的庫容，在噬菌體展示文庫構建過程中，使用比較多的感受態細胞有TG1、XL1-Blue、SS320等。在進行轉化實驗時，要想獲得高的轉化效率，質粒和連接產物的純度、電轉的條件、質粒和連接產物的加入量以及操作的規范性也是尤為重要的。

Q6. 建庫引物設計原則

A. 引物長度為20-30個堿基，既能保證與目標序列的結合，又能降低引物間的相互干擾。引物Tm值應略高于目標序列的解鏈溫度，以便在PCR過程中順利結合。引物的GC含量應接近目標序列的GC含量，以提高引物與目標序列的結合效率。避免引物的自我互補，以免影響PCR擴增效果。盡量不要選擇簡并引物。

Q7. 噬菌體文庫的保存方法

A. 不當的保存方法會降低噬菌體的效價，原則上噬菌體文庫在50%的甘油中低溫保存（-70℃以下）可以保存較長時間。

Q8. 抗原的呈遞方法及適用條件

A. 抗原的呈遞方法有直接包被的抗原呈遞、間接包被的抗原呈遞、通過完整細胞篩選的抗原呈遞等方法。直接包被的抗原呈遞適用于分子量較大，構象穩定的抗原，間接包被可用于直接包被效果較差，抗原分子量較小，表位難以充分暴露的靶分子，就可以借助生物素-鏈霉親和素系統或者其他的標簽分子進行抗原的固定，提高抗原呈遞的效果。由于重組表達的抗原與細胞膜上的抗原構象不一致，導致使用重組蛋白進行篩選無法獲得結合細胞膜表面抗原的抗體時，我們可以采用HEK或CHO細胞構建瞬轉或穩轉過表達細胞系，或高表達腫瘤細胞系，來呈遞抗原，使用細胞直接進行篩選。

詳細內容請參閱公眾號文章--------噬菌體展示抗體篩選之抗原呈遞

Q9. 篩選方法

A.常見的篩選方法有正篩選，負篩選，競爭篩選，交叉篩選等。

正篩選是最基礎的篩選方式，直接篩選到結合靶蛋白的噬菌體抗體。

負篩選是針對性去除非特異性抗體的手段，在噬菌體抗體篩選過程中，靶抗原的標簽與材料、與靶抗原結構相似的抗原干擾等原因容易使我們篩選到非特異抗體，此時我們可以進行負向篩選，提高篩選效率。

競爭篩選是將抗體與靶抗原和非靶抗原同時結合，可篩選到針對靶抗原親和力更高的抗體，同時扣除結合非靶抗原的部分抗體。

交叉篩選目的在于降低抗體富集的偏向性，主要針對不同物種之間的抗原，可以采用使用不同物種的同個抗原進行交叉富集篩選，提高獲得交叉抗體的可能性。

詳細內容請參閱公眾號文章--------噬菌體展示抗體篩選之篩選策略

Q10. 如何避免篩選到非特異性抗體

A. 在噬菌體篩選過程中，很多原因會導致篩選到非特異性抗體，針對不同的情況我們有不同的解決措施，例如，篩選到與抗原標簽結合的非特異性抗體，我們可以選擇更換不同標簽的抗原進行篩選，或者進行負篩選來降低非特異性抗體的比例。如果篩選到結合封閉液的抗體，我們可以選擇更換合適的封閉液，或者交叉使用不同的封閉液來避免這種情況。如果是篩選到識別背景細胞系（CHO或者HEK293)的抗體,可以更換不同的背景細胞系進行篩選或者進行負篩選。

Q11. 如何篩選得到多樣性好、高親和力的抗體

A. 靶分子的濃度，結合時間，洗滌強度不同可能都會導致篩選結果的差異，抗原和抗體結合是一個動態的過程，高親和力的抗體在較大的選擇壓力下也依然能夠與抗原有力的結合，因此我們可以采用增大選擇壓，如降低靶分子濃度，減少結合時間，增大洗滌強度來篩選更高親和力的抗體。相反，若想要獲得多樣性更好的抗體，我們需要減小選擇壓，尤其是在進行第一輪篩選時能夠從構建的文庫中盡量多地捕獲陽性克隆，才能保持文庫的多樣性，保證一輪的洗脫產物在10^4~10^7 之間，不能高于這個數量級也不能低于這個數量級。

Q12. 陽性克隆的檢測方法

A. 篩選獲得的噬菌體抗體經過輔助噬菌體的包裝之后會在pⅢ蛋白上融合表達，我們就可以采用酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)或者流式細胞熒光分析技術（FACS)進行檢測。

①Phage ELISA

phage ELISA是最常用的檢測方法，將抗原包被到酶標板上，封閉之后加入噬菌體上清液，再加入辣根過氧化物酶標記的抗M13二抗，最后進行顯色。一般情況下在OD450波長顯色值到達1.0以上我們認為是陽性克隆。

②Phage FACS

利用流式細胞熒光分析術檢測噬菌體抗體與細胞的結合情況，噬菌體上清結合細胞之后再加入熒光標記的抗M13二抗，根據熒光信號判斷檢測克隆是否為陽性克隆。

③細胞裂解液

由于M13噬菌體是絲狀的，非常長，容易粘連，導致非特異。對于天然文庫與合成文庫，盡量不要采用phage-ELSIA的方法進行克隆驗證，而是盡可能的利用TG1宿主菌20%的泄露表達，再采用噬菌粒上的標簽進行檢測。

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