前言

BiTE是一種雙特異性 T 細胞接合劑，已被開發為免疫治療分子。傳統的 T-cell engager（BiTE）構建由兩個單鏈可變抗體片段（scFv）組成，分別靶向腫瘤相關抗原（TAA）和T細胞標記物。第一個scFv-BiTE，靶向CD3和CD19的Blinatumomab^?于2014年12月被FDA批準用于治療白血病，但在使用BiTE治療實體腫瘤治療方面，容易引起嚴重脫靶等不良事件，效果不佳。為了克服傳統 BiTE 的局限性，開發新的 BiTE 勢在必行，基于納米抗體的 BiTE （Nb-BiTE）就是這樣的候選者之一。本期小編給大家介紹一種增強T細胞免疫治療的新平臺—Nb-BiTE。該分子通過將 T 細胞和腫瘤靶標結合，誘導T細胞產生對腫瘤細胞的細胞毒性，來增強免疫治療。

研究亮點

該項研究報道了一種由兩個Nb構建的BiTE，分別靶向T細胞表面的CD3分子和實體腫瘤表面的CD105分子，目前關于兩個結構均為Nb的BiTE少見報道。文中假設CD105-CD3/Nb-BiTE通過CD3 Nb末端與T細胞CD3抗原之間的特異性結合以及CD105 Nb特異識別和結合TAA，來觸發TCR/CD3復合物的構型變化，從而啟動膜信號轉導并激活腫瘤特異性 T 細胞。這種激活會導致T細胞增殖和細胞因子的分泌，從而增強抗腫瘤免疫反應。

CD105-CD3/Nb-BiTE構建及驗證

采用hCD3和hCD105蛋白免疫健康的駱駝，收集PBMC后采用噬菌體展示平臺篩選Nb，將CD3 Nb和CD105 Nb的基因序列通過Gly4Ser連接在一起，形成CD105-CD3/Nb-BiTE，它可將T細胞重定向至腫瘤細胞和心血管內皮細胞（圖1a）。以同種方式構建TTE-CD3/Nb-BiTE，作為同型對照。通過PCR將Nb-BiTE克隆到質粒中，電轉，表達，純化，成功表達出Nb-BiTE，SDS-PAGE顯示大小為35KD左右（圖1b）。

圖1 CD105-CD3/Nb-BiTE 的構造和機理示意圖

CD105-CD3/Nb-BiTE作用機制的研究

為了驗證CD105-CD3/Nb-BiTE與靶點的特異性結合，研究者將不同類型的細胞與CD105-CD3/Nb-BiTE混合孵育，并用PE偶聯的抗his單抗（Sigma-Aldrich，USA）對細胞表面的CD105-CD3/Nb-BiTE進行染色。在每個實驗組中，用PBS進行空白對照，TTE-CD3/Nb-BiTE作為陰性對照，使用流式細胞術分析結合率。

實驗結果顯示，表達CD105的細胞（如Bel7404 HepG2 TDVEC細胞）與CD105-CD3/Nb-BiTE有很高的結合率，而CD105陰性的細胞（如SCC9 293T細胞）則不與CD105-CD3/Nb-BiTE結合。值得注意的是，TTE-CD3/Nb-BiTE幾乎不與各種類型的細胞結合。這些結果表明，CD105-CD3/Nb-BiTE與靶點具有高度特異性結合(圖2)。

圖2 CD105-CD3/Nb-BiTE 與不同類型細胞結合流式圖

進一步檢測CD105-CD3/Nb-BiTE是否具有激活T細胞并增強其對腫瘤細胞的殺傷作用。從體內治療試驗后的腫瘤中分離出T細胞，并通過流式細胞術分析這些細胞的表型變化。結果顯示，CD105-CD3/Nb-BiTE能夠促進T細胞表達CD25和CD69分子，這兩個分子通常與T細胞的活化和增殖相關（圖3d和e）。此外，在一定效靶比（E:T=10:1）下，CD105-CD3/Nb-BiTE能夠以劑量依賴的方式增強T細胞對特定靶腫瘤細胞（Bel7404）的裂解作用，但對不表達CD105的293T細胞無影響（圖3f）。這表明CD105-CD3/Nb-BiTE的激活作用是特異性的，主要針對表達CD105的腫瘤細胞。CD105-CD3/Nb-BiTE還能促進T細胞分泌幾種抗腫瘤細胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，并且這些細胞因子的含量可以通過酶聯免疫試劑盒在腫瘤細胞懸液中進行測定（圖3g）。同時發現CD105-CD3/Nb-BiTE對健康的 BALB/c 小鼠無組織毒性（圖3h）。這些結果進一步支持了CD105-CD3/Nb-BiTE在免疫治療中的潛在應用價值。

圖3 CD105-CD3/Nb-BiTE激活T細胞并增強其對腫瘤細胞的殺傷作用

CD105-CD3/Nb-BiTE體內藥效的評估

為了檢測CD105-CD3/Nb-BiTE的體內藥效作用，通過皮下植入HepG2細胞，在NOD/SCID小鼠中建立癌細胞系來源的異種移植物（CDX）模型，五日后給藥。每天一次，連續五天經尾靜脈向小鼠注射CD105-CD3/Nb-BiTE（10 μg）和人T細胞（4×107）的混合物，以評價其抗腫瘤療效（圖i）。統計小鼠存活數量后，制作接受治療至倫理終點（90天）的小鼠的Kaplan-Meier生存曲線（圖j）。第一次給藥后，測量腫瘤大小，計算體積，后每三天測量一次。使用GraphPad Prism軟件進行統計分析，制作給藥后30天內接受治療的小鼠的腫瘤體積分布圖（圖k）。

結果顯示，接受CD105-CD3/Nb-BiTE治療組小鼠比其它所有對照組存活時間都要長，60%的小鼠到試驗終點仍然存活。圖k表明，與其它對照組相比，CD105-CD3/Nb-BiTE是抑制腫瘤生長的最佳藥物。

圖4 CD105-CD3/Nb-BiTE體內藥效評估

小結

CD105-CD3/Nb-BiTE在體外和體內均顯示出優異的安全性和治療效果。這種雙特異性納米抗體BiTE，可能會成為促進T細胞免疫治療的通用平臺。這歸因于納米抗體自身的優勢，如體積小、結構簡單、穩定性、多功能性、易于設計和生產，最重要的是，具有高特異性和安全性。

參考文獻：

Yang XM, Lin XD, Shi W, Xie SX, Huang XN, Yin SH, Jiang XB, Hammock BD, Xu ZP, Lu XL. Nanobody-based bispecific T-cell engager (Nb-BiTE): a new platform for enhanced T-cell immunotherapy. Signal Transduct Target Ther. 2023 Sep 4;8(1):328. doi: 10.1038/s41392-023-01523-3. PMID: 37661200; PMCID: PMC10475457.

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