前言  
自1986年第一個治療性抗體進入臨床后，越來越多的治療性抗體得到迅速發展，抗體藥也成為現代生物醫學重要的組成部分。大多數抗體藥物的給藥方式為靜脈注射，少數為皮下注射或肌肉注射。其給藥方式的限制，桎梏了較多靶點的臨床廣泛應用。而1989年從駱駝科中發現的納米抗體，不僅刷新了人類對抗體的認識，更給抗體藥的給藥方式帶來了革新，發現更多的給藥方式可通過其實現。小編今天為大家介紹納米抗體藥物在吸入式給藥、皮下注射給藥、口服遞送以及跨血腦屏障遞送中的應用研究。

VHH結構特點及給藥優勢

納米抗體是在駱駝科及鯊魚科動物血清中大量存在的天然重鏈抗體(HcAb)的可變結構域(VHH/IgNAR)，是目前已知的可結合目標抗原的最小單位。

圖2KN035/PD-L1整體結構[3](a為KN035序列和結構，b為KN035/PD-L1結合結構

納米抗體吸入式給藥

吸入式給藥是指一些氣體及揮發性藥物經過呼吸道直接進入肺泡，由肺泡表面吸收，產生全身作用的給藥方式。由于肺泡表面積大，又與血液只隔肺泡上皮及毛細血管內皮各一層，且毛細血管內血流量又大，故吸收迅速。氣體或揮發性藥物吸入后，由肺上皮和呼吸道黏膜吸收，對肺部疾病可使藥物直接作用于病變部位。傳統抗體的吸入式遞送存在挑戰性，并且其抗體需要具有制備和遞送所需的有利物理化學性質。

1.治療新冠感染的作用機制及案例

自2019年12月開始，一種新型、高傳染性的嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2，COVID-19）在全球范圍內爆發，已造成數億人感染。與其他人畜共患冠狀病毒（SARS-CoV-1、MERS）一樣，新型冠狀病毒表達一種表面Spike (S)糖蛋白，該蛋白由兩個亞基S1和S2組成，形成同源三聚體S蛋白。這種同源三聚體S蛋白可以與宿主細胞相互作用。新型冠狀病毒與宿主細胞之間的相互作用是由S1亞基的受體結合結構域（RBD）介導的，該結構域與血管緊張素轉換酶2（ACE 2）的肽酶結構域（PD）結合。之后，S2亞基發生了劇烈的構象變化，并引發了膜融合。新型冠狀病毒S蛋白與ACE2（Kd為15 nM）的結合親和力是SARS-CoV-1 S蛋白的10-20倍，推測這可能是SARS-CoV- 2更具傳染性的原因^[3]。

盡管傳統單克隆抗體的治療能夠減緩病者的病情，但其高劑量的使用也反映出靜脈給藥效率低，同時傳統的單克隆抗體不能快速、低成本地生產，也不能快速開發針對突變病毒株的抗體藥物，不易優化。而具有優良理化性能的納米抗體則能很好的解決這些問題。它們可以霧化，吸入給藥，并直接應用于感染部位，肺部藥物濃度高，高生物利用度，只需少量藥物就能達到效果，既降低用藥成本，也降低副作用發生風險。因此，在治療呼吸道病毒方面具有非常潛力。

圖3 新冠病毒結構 https://cn.bing.com/images

2020年 UCSF Michael Schoof團隊報道了AeroNabs分子氣霧劑，基于合成文庫中篩選出的納米抗體分子，可與鼻噴霧劑或吸入器一起用于個人預防2019冠狀病毒?。–OVID-19）。該納米體能夠破壞SARS-CoV-2棘突與宿主細胞受體的相互作用。

來自匹茲堡大學的項宇飛和合作者用重組SARS-CoV-2 RBD免疫駱駝，使用蛋白質組學方法和質譜分析，鑒定了大量高效的SARS-CoV-2中和納米抗體。研究發現，幾種納米抗體在極低的劑量下中和了SARS-CoV-2，半抑制濃度低于pmol。他們構建了多價VHHs，并實現了超高的中和效率（半抑制濃度低至0.058 ng/ml），并可能防止突變病毒株逃逸。這些熱穩定的VHHs可以由微生物快速大量生產，并且能夠抵抗冷凍、干燥和霧化。他們進一步將最有效的三價 Tri-Nb21開發成PiN-21氣溶膠，可以有效預防和治療感染SARS-CoV-2的敘利亞倉鼠，大大降低病毒載量，預防肺損傷和病毒性肺炎^[3]。

2.洛啟生物——IL4R

哮喘是世界公認的醫學難題，被世界衛生組織列為疾病中四大頑癥之一，也成為僅次于癌癥的世界第二大致死和致殘疾病。哮喘的用藥包括靜脈、皮下、口服和吸入等方式，其中吸入給藥是最佳的給藥方式，能直達肺部病灶區，避免肝臟的首過效應，減少系統性暴露毒性，規避皮下給藥的副作用。

2021年11月26日，洛啟生物宣布申報霧化液LQ036，一種靶向IL-4R的納米抗體創新藥。這是由洛啟生物自主研發的針對中重度哮喘治療的核心藥物，也是全球首款重度哮喘治療吸入式納米抗體藥物。洛啟生物的LQ036相比于阿斯利康的IL-4R吸入式骨架蛋白產品PRS-060，給藥頻率更低，活性更高。該藥有望為全球哮喘患者提供新的治療方案。

納米抗體口服遞送

對于慢性疾病，用藥的便利性是一個重要的評價因素和競爭點，口服給藥不僅提高用藥的便利性，還能減少系統性的免疫抑制帶來的諸多毒副作用，前景可期。但是口服蛋白質或者肽類藥物，需要克服胃酸、胃/胰蛋白酶、黏液屏障和上皮屏障重重困難，截止目前僅有少數的蛋白質/多肽類藥物獲批。

1.口服遞送藥物V565

VHsquared公司從TNF-α免疫羊駝的納米抗體噬菌體文庫中，篩選獲得對胃腸道蛋白酶具有天然耐受性的TNF-α中和納米抗體，對其做進一步的結構改造以增強其抗蛋白酶水解的能力，最終得到分子V565。VHsquared公司對V565的劑型做了針對性的設計，將其制成口服的腸溶小片，開發用于局部治療炎癥性腸?。↖BD）患者。

圖4 腸溶小片V565口服后在胃腸道中的溶解示意圖。

口服用藥時，膠囊殼在胃里很容易溶解，釋放出腸衣型V565微小藥片。這些藥片在低pH值下能抵抗溶解，并完整地通過幽門。當V565微小藥片通過腸道時，pH值增加，引發腸溶包衣的溶解，使活性V565被釋放出來。在IBD患者中，V565將進入腸道上皮損傷部位的發炎固有層，而過量的V565不會與腸道上皮結合，將通過淋巴被清除并進入血液循環。https://doi.org/10.1080/03639045.2018.1542708.

體外蛋白酶耐受性檢測實驗結果表明，V565對多種胃腸道溶液和金屬蛋白酶具有抵抗能力。V565的I期臨床試驗數據顯示^[4]，V565分子在克羅恩病患者的組織中有明顯的高濃度分布。同時，口服7天后，活體組織切片中信號通路蛋白的磷酸化水平降低約50%，顯示了藥物對TNFα相關的信號通路的抑制作用。

目前，V565正在進行II期臨床試驗(NCT02976129)?？贵w口服給藥的嘗試非常有意義，V565會有怎樣的進展讓我們拭目以待。

2.口服遞送抗ETEC的納米抗體

致病性腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli ，ETEC) 是一種非侵入性病原體。ETEC可通過其表面的定植因子 (CF) 介導小腸粘附，一旦與小腸結合，細菌就會產生毒素，導致水樣腹瀉，據估計，ETEC在全球零星或流行性爆發期間每年會導致大約 380,000 人死亡。由于ETEC菌株的巨大異質性，開發有效地覆蓋多種遺傳變異的 ETEC 菌株的疫苗非常具有挑戰性，目前為止還沒有獲批的ETEC預防型疫苗。

馬薩諸塞大學醫學院Wangyang團隊^[5]通過免疫美洲駝，經篩選獲得識別ETEC細菌表面的定植因子粘連素亞基 (CfaE) 的VHHs，體外實驗中這些VHHs顯示出針對 11 種主要致病性 ETEC 菌株的交叉結合效力。

為了獲得最佳功能并提高VHHs在粘膜中的穩定性，研究者將VHH設計成IgAFc融合抗體（VHH-IgA）給小鼠口服(圖5），發現VHH-IgA可以有效地降低小鼠腸道中的致病菌數量，并且效果優于商業化的抗菌藥物Travelan^?（圖6）。Wang yang團隊研發的可口服遞送的抗CfaE納米抗體對進一步合理設計泛ETEC疫苗有實踐參考價值。

圖5 圖示VHH給藥的預處理方案。

在灌胃10E7CFU的H10407之前一或兩小時進行VHH-IgA灌胃給藥。

圖6 2R215-mIhA2和1D7-mIgA2對致病菌的抑制效力優于Travelan。

納米抗體跨血腦屏障遞送

血腦屏障（BBB）是指腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止某些物質由血液進入腦組織，同時也阻止了大多數小分子藥物和大分子（例如肽，蛋白質和基于基因的藥物）的轉移。

圖7 血腦屏障（BBB）結構。https://cn.bing.com/images

血腦屏障是一把雙刃劍，雖能阻止有害物質進入我們的腦組織，卻也阻擋了治療藥物的進入。它允許關鍵化合物通過幾種途徑從血液中選擇性地進入大腦，如營養物質、信號分子和激素，包括被動融合、受體介導的胞吞（RMT）、吸附介導的胞吞（AMT）和載體介導的轉運（CMT）。

目前針對神經中樞系統疾病治療的方法，如直接注射或破壞血腦屏障使其產生“漏洞”，具有感染、組織損傷和神經毒性等風險，因此跨血腦屏障遞送藥物對相關疾病的治療具有重大意義。

圖8 大腦中受體介導的胞吞作用（RMT）和吸附介導的胞吞作用（AMT）過程的示意圖^[6]

中樞神經系統疾病的治療藥物必須克服血腦屏障，并在大腦中達到有效的濃度。一種很有前途的策略是通過胞吞作用(RMT)系統進行運輸，該系統使用靶向轉鐵蛋白受體（TfR）或胰島素受體（IR）的抗體作為載體，協助藥物穿過血腦屏障。對于這些策略，VHH顯示出獨特的優勢，具有穿透血腦屏障后穿透腦實質的顯著能力。研究表明，與傳統的單克隆抗體相比，VHH具有更小的體積，可以到達更深的腦組織，并具有更廣泛的腦暴露，而且具有更高的穩定性。目前，研究人員已經開發了多個VHHs（表1，圖9），用于作為通過血腦屏障治療中樞神經系統疾病的載體或作為神經成像工具。同時在朊病毒治療與阿爾茲海默癥治療上有明顯成效。

圖9 融合蛋白的結構和特征。a：FC5與人Fc融合的分子結構。b：融合蛋白：FC5作為攜帶藥理蛋白mGluR1的載體。c ：TfRMAb結構域是血腦屏障傳遞的載體。d :HIRMAb與治療性蛋白抗AβscFv融合，用于治療阿爾茨海默病^[6]

1.納米抗體用于朊病毒治療的研究

朊病毒疾病，也被稱為傳染性海綿狀腦?。═SEs），參與了細胞朊病毒蛋白（PrPC）錯誤折疊成與疾病相關的亞型癢病朊蛋白（PrPSC）。蛋白質的沉積和聚集表現出神經毒性，并導致腦實質的海綿狀變化。研究人員^[2]從免疫駱駝構建的噬菌體展示文庫中篩選出VHH PrioV3。經過深入的研究表明，VHH PrioV3與PrPC和PrPSC的線性表位都有很高的結合能力。此外，整合細胞的免疫熒標記顯示，PrioV3具有穿透細胞膜并與細胞質PrPC結合的能力。它還能在體外穿過大鼠和人腦微血管內皮細胞形成的人工血腦屏障，并在大鼠靜脈注射后在腦實質中有效融合，證明了體內穿過血腦屏障的特性。到達靶點后，PrioV3能完全展現出其藥理作用并且能廣泛消除PrPSC在朊病毒神經元細胞中的復制。

2.納米抗體用于阿爾茲海默癥治療的研究

阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病。Aβ肽纖維的形成是AD中常見的生化特征，被認為是一種假定的致病因素。研究靶向Aβ肽的VHHs，可用于開發新的治療方法。

研究人員從一個非免疫的、抗Aβ的噬菌體展示文庫中篩選出VHHs ni3A和ni8B[7]。隨后證明，兩種VHHs在體外比FC5（圖9）表現出更有效的血腦屏障交叉能力。在另一項關于這兩個VHHs的研究中，在框架區（FR1）中有三個氨基酸，ni3A表現出更高的遷移能力，說明氨基酸序列可能是其穿過BBB的關鍵?；谶@一假設，該項目的研究人員將ni3A的FR1與另一個缺乏跨越血腦屏障能力的VHH va2E的CDR1-FR4結合，構建了一個新的VHH 3A2E^[6]。隨后的體外血腦屏障傳代實驗表明，新型VHH 3A2E相比VHH va2E具有更高的遷移率。進一步的實驗在排除了年齡、疾病和高劑量導致血腦屏障中斷的可能性后證明了VHHs能夠在體外和AD小鼠模型中能夠穿過血腦屏障。

其他團隊的研究人員^[8]從兩個免疫的噬菌體展示VHH文庫中篩選出靶向Aβ肽的VHH—R3VQ和靶向磷酸化tau蛋白的VHH—A2。研究發現，兩者都與大腦靶點的細胞外（淀粉樣斑塊）和細胞內（神經纖維纏結）有特異的結合。此外，進一步的實驗證明了VHHs能夠在體外穿過血腦屏障的能力并在靜脈注射的AD小鼠模型中，排除了年齡、疾病和高劑量導致血腦屏障中斷的可能性。雖然，VHHs的快速血液清除率和相對較高的腎臟潴留可能會損害體內結果及其在治療中的應用，但它們可以進一步發展為很有前途的不同淀粉樣蛋白沉積的診斷工具。

小結 
傳統抗體給藥的方式受到限制，比較單一。相較于傳統抗體，納米抗體獨特的理化性能優勢，使更多的給藥方式可通過其實現，相信隨著免疫療法和工藝技術的進展，納米抗體藥物在未來將有更多的臨床應用。

參考資料：

[1]Arghavan Soleimanizadeh, et al. Central Nervous System Delivery of Antibodies and Their Single-Domain Antibodies and Variable Fragment Derivatives with Focus on Intranasal Nose to Brain Administration.Antibodies 2021, 10, 47.

[2]Fangfang Chen, et al.Prospects of Neutralizing Nanobodies Against SARS-CoV-2.Frontiers in Immunology.2021;5.

[3]Zhang F, Wei H, Wang X, et al. Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immune checkpoint blockade[J]. Cell discovery, 2017, 3(1): 1-12.

[4]Nurbhai, et al. Oral Anti-Tumour Necrosis Factor Domain Antibody V565 Provides High Intestinal Concentrations, and Reduces Markers of Inflammation in Ulcerative Colitis Patients. Sci Rep 9, 14042 (2019).

[5]Amcheslavsky A,et al. Anti-CfaE nanobodies provide broad cross-protection against major pathogenic enterotoxigenic Escherichia coli strains, with implications for vaccine design. Sci Rep. 2021 Feb 2;11(1):2751. doi: 10.1038/s41598-021-81895-0.

[6]Yang Gao, et al..Single domain antibody?based vectors in the delivery of biologics across the blood brain barrier: a review.Drug Delivery and Translational Research.2020;10.

[7]Li T, et al. Camelid single-domain antibodies: A versatile tool for in vivo imaging of extracellular and intracellular brain targets. J Control Release. 2016;243:1–10.

[8]Rutgers KS, et al. Diferential recognition of vas cular and parenchymal beta amyloid deposition. Neurobiol Aging.  2011;32(10):1774–83.

了解更多納米抗體相關內容，可關注<阿帕克生物>微信公眾號，獲取最新資訊~