前言

在細胞治療中，CAR識別表位對于免疫治療效果有非常重要影響。目前CAR-T在實體瘤治療中發展較為緩慢，B7-H3是一個新興的CAR-T實體瘤治療靶點，其胞外域包含兩個不同的表位基序：IgC和IgV。本文介紹一項基于納米抗體的B7-H3 CAR-T細胞治療產品，該產品亮點是其中的中B7-H3納米抗體識別IgC而非IgV表位而對小鼠實體瘤模型表現出更加有效的抗腫瘤活性。

4IgB7-H3是實體瘤中的主要亞型

人B7-H3包括兩種亞型，2IgB7-H3 (2Ig)和4IgB7-H3 (4Ig)。檢測轉錄本分析發現，B7-H3在各種腫瘤組織及細胞系中異常高表達，并與胰腺癌和神經母細胞瘤患者低的總生存期相關。而4IgB7-H3亞型是在胰腺癌和神經母細胞瘤等多種實體瘤類型中表達的主要亞型，且4Ig是高度糖基化的（圖1），這也表明4IgB7-H3亞型可以作為癌癥免疫治療的泛癌靶點。

圖1. 4IgB7-H3在多種實體癌中高度過表達

靶向B7-H3納米抗體開發

使用噬菌體展示技術從8個單峰駱駝VHH納米抗體庫((>1E12 pfu/ml total) 中篩選出針對4IgB7-H3的納米抗體。獲得10個克隆與人4IgB7-H3蛋白結合，通過ELISA、動力學抗體結合、WB和流式細胞術技術檢測發現，其中高親和力的納米抗體C4、B12和G8與腫瘤細胞上表達的天然4IgB7-H3結合（圖2）。

圖2 4IgB7-H3高親和力納米抗體開發

靶向B7-H3納米抗體識別表位鑒定

通過在Octet平臺上進行4IgB7-H3抗原的交叉競爭測定發現，G8和已知的抗B7-H3的單克隆抗體376.96在4IgB7-H3的IgV結構域具有重疊表位。通過研究從哺乳動物細胞中純化的抗原片段與VHH-Fc的相互作用，發現B12和C4與4IgB7-H3 IgC結構域的不同區域結合（圖3）。

圖3 抗B7-H3納米抗體的表位預測

基于B7-H3納米抗體的CAR-T細胞在體外殺傷人胰腺癌和神經母細胞瘤細胞

將單個VHH片段插入到臨床上使用的CAR載體中來生成B7-H3 CAR-T細胞，而后將其與腫瘤細胞系共孵育，發現它以抗原依賴的方式顯著殺傷胰腺癌（Panc-1）和神經母細胞瘤細胞系（IMR32、IMR5）。盡管基于納米抗體的CAR-T細胞和基于376.96 scFv的CAR-T細胞對IMR5腫瘤細胞具有相當的細胞毒性，但B12（VHH）-CAR-T細胞釋放的細胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）水平明顯更高?？乖Y合能力和抗體阻斷實驗表明，B12（VHH）-CAR-T細胞具有更高的抗原結合能力，且天然4IgB7-H3抗原參與細胞功能的激活。通過CAR-Jurkat NF-κB和NFAT報告細胞系評估發現B12（VHH）-CAR激活活性最強，可能的原因是因為其更強的抗原結合能力（圖4）。

圖4 基于B7-H3納米抗體的CAR-T細胞在體外有效殺傷胰腺癌和神經母細胞瘤細胞

基于B7-H3納米抗體的CAR-T細胞根除小鼠胰腺癌

為了臨床前評估基于B7-H3納米抗體的CAR-T細胞的抗腫瘤功效，在20天后向Panc-1轉移異種移植小鼠模型單次注射250-1000萬個CAR-T細胞，發現B12（VHH）-CAR-T細胞和C4（VHH）-CAR-T均能顯著消除腫瘤負荷。治療后再次激發腫瘤，發現腫瘤快速縮小，表明小鼠體內已具有持久性的CAR-T活性。在250萬個CAR-T細胞劑量下，發現靶向B7-H3 IgC結構域的B12（VHH）-CAR-T和C4（VHH）-CAR-T細胞相較于靶向B7-H3 IgV的376.96（scFv）-CAR-T和G8（VHH）-CAR-T細胞對Panc-1保持了更高的抗腫瘤療效，從而延長小鼠生存時間。類似的，250萬個B12（VHH）-CAR-T細胞可以顯著消退原位胰腺癌小鼠模型中的Panc-1原位腫瘤（圖5）。

圖5 基于B7-H3納米抗體的CAR-T細胞在小鼠中對人胰腺癌抗腫瘤活性

B12（VHH）-CAR-T細胞對小鼠轉移性和大實體瘤具有最強的抗腫瘤活性

研究發現B12（VHH）-CAR-T細胞通過介導腫瘤細胞殺傷，對小鼠模型中的IMR5轉移性神經母細胞瘤、大至400-800 mm3的NBEB神經母細胞瘤異種移植瘤和大至250 mm3的BxPC-3胰腺癌異種移植瘤均表現出顯著的腫瘤生長抑制，且這種抑制是B7-H3靶向性的。而C4（VHH）-CAR-T和376.96（scFv）-CAR-T細胞僅顯示出有限的療效（圖6）。

圖6 B12（VHH）-CAR-T細胞抑制異種移植中轉移性和大型腫瘤生長

小結

B7-H3在各種實體瘤中異常過表達，其4IgB7-H3亞型作為常見亞型，是開發免疫治療的潛在靶點。本研究報道的靶向B7-H3的納米抗體可以與4Ig和2Ig蛋白結合，其中基于B12 (VHH)的CAR-T細胞識別4IgB7-H3 IgC結構域中的獨特表位，對小鼠晚期轉移性和大型實體腫瘤具有良好的抗腫瘤作用。這項研究證明了基于VHH的CAR-T細胞治療包括胰腺癌和神經母細胞瘤在內的實體瘤的潛力，并為在CAR-T細胞治療中CAR識別表位影響提供一種解決策略。

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參考文獻：

Li, D., Wang, R., Liang, T. et al. Camel nanobody-based B7-H3 CAR-T cells show high efficacy against large solid tumours. Nat Commun 14, 5920 (2023). doi: https://doi.org/10.1038/s41467-023-41631-w

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